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WB经验之蛋白胶注意事项
lijing320323
2022/10/19
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食品常规理化分析
8.增加上样量不一定会提高荧光信号强度。增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连,所有的蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提高几倍,而WB灵敏度是以10的几次幂量级的,所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集(可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍,并去除其它杂蛋白干扰)。增加上样量的另一个坏处是,本来高表达的蛋白,诸如内参,在同样WB条件下,可能出现荧光灼烧式粹灭(一晃而灭)或者条带中空。
仍以6孔板80%以上汇合度为例,细胞裂解液和SDSLB通常都是投入200ul(最少80ul,这
样面积的培养板如果裂解液投入太少,回收时的损失就太大,上样就很难做到一致),而这种浓度条件下制备的样品,电泳时上样量要控制在5-6ul,最少2.5ul,最多10ul,10ul时内参基本已经开始粘连成一条线,带型出现波浪纹;当然并非不可以多上样,再多对WB结果影响不大(没有的仍然没有),且条带都很丑。
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