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克隆形成实验及划痕实验、流式细胞术操作步骤
小小矮马
2022/11/23
小矮马
私聊
分离/萃取
克隆形成实验
及划痕实验
、
流式细胞术
操作步骤
软琼脂克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力
软琼脂克隆形成实验适用于悬浮生长的细胞。
1. 配胶液:用蒸馏水和琼脂糖粉配制浓度为 0.3% 的琼脂糖液,高压灭菌,置于42℃ 水浴锅中,目的是为了使其保持融化状态。
2. 配制含 20% FBS 的 2×1640 培养基,用 0.22 ?m 的滤器过滤除菌。
3. 铺下层胶:将 0.6% 的琼脂糖胶液与 2×1640 培养基等体积混合,以每孔 1.5mL 加至 6 孔板中,室温等其凝固。
4. 细胞计数:将细胞用 PBS 洗一遍,离心,加入新的培养基混匀稀释,计数。H69-NC、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2 均以 1×104/孔铺入 6 孔板。
5. 铺上层胶:将 0.3% 的琼脂糖胶液与 2× 培养基 1:1 混合,加入 100 μL 细胞悬液,混匀后,每孔加入 1.5 mL 混合液。
6. 放入 37℃,5%CO2 培养箱培养,约 2-3 周后终止培养。
7. 比较细胞克隆形成能力的差异,利用 Graphpad prism5 作图计算两种细胞克隆形成能力的差异。
平板克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力
平板克隆形成实验适用于贴壁生长的细胞。
1. 细胞处理:将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞,用 PBS洗一遍,用胰酶消化并计数。
2. 接种细胞: 将细胞接种于 6 孔板中, SW1271-NC 、SW1271-shMSI1-1 、SW1271-shMSI1-2 接种密度为 3×103/孔,注意一定让细胞均匀分布。于 37℃,隔离CO2 静置培养 2-3 周(终止培养时间以不小于 2 周且克隆之间不发生融合为标准)。
3. 出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去旧培养基, 用 PBS 清洗 2 次,用 4% 多聚甲醛固定液固定 20 min,吸除固定液,用蒸馏水清洗 2 次后加适量结晶紫染色15-20 min,用蒸馏水洗去结晶紫,自然风干,用扫描仪扫描成图片。
4. 在低倍镜下计数大于 50 个细胞的克隆数。
5. 计算克隆形成率。
细胞划痕实验
1. 用记号笔在 12 孔板底部划两条平行线做为标记。
2. 将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞接种至 6 孔板。
3. 待细胞汇合度为 90% 左右时,用 10μL 枪头垂直于两条平行标记线进行划痕。
4. 吸除培养基,1xPBS 漂洗 2 次,并换用无血清培养基培养。
5. 分别在划痕后培养 0h,12h,24h,48h,72h 观察细胞迁移情况并拍照。
流式细胞术
1. 收集 H69、H82、H526、SW1271 的对照组和实验组细胞(包括培养上清中的细胞),收集 1 - 10 ×105 个细胞,用预冷 PBS 离心洗涤。用双蒸水稀释 5 ×Binding Buffer为 1 × 工作液,取 500 μl 1 × Binding Buffer 重悬细胞。
2. 每管加入 5 μl Annexin V-APC 和 10 μl 7-AAD。
3. 轻柔涡旋混匀后,室温避光孵育 5 分钟。
4. 上机进行分析。
附件:
LD6.docx
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