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质粒提取的原理、方法及常见问题解析

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2023/09/13

生命科学仪器综合讨论

一、质粒提取的原理：

质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。

从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。

在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型。

质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA；松弛开环的OC构型；超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边；道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间。

二、质粒提取方法

质粒DNA的提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法。跟据不同的实验目的和仪器设备择取不同的实验方案。

三、质粒提取的常见问题

1.时间控制问题

裂解时间太长，加入溶液P2后裂解时间不应超过5 分钟；吸附时间不够；溶解时间不够都会导致质粒DNA提取实验失败。

2.大肠杆菌老化

建议涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

3.质粒拷贝数低

由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA 提取量低，可更换具体相同功能的高拷贝数载体。

4.溶液使用不当

溶液P2、P3 在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

5.吸附柱过载

不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB 或者 ×YT 菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB 培养液体积。

6.质粒未全部溶解

洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

7.乙醇残留

漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。

8.洗脱液加入位置不正确

洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

9.洗脱液不合适

DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱。洗脱效率取决于pH 值。最大洗脱效率在pH7.0～ 8.5 间。当用水洗脱时确保其 pH 值在此范围内，如果pH 过低可能性导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加暖至 60 ℃后使用有利于提高洗脱效率。

10.洗脱体积太小

洗脱体积对来回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积

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