1藤三七多糖对·OH清除率的测定（H2O2/Fe2+体系法）
1.1 H2O2/Fe2+反应体系原理
Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应,在H2O2/Fe2+体系法中通过Fenton反应，H2O2产生·OH，邻二氮菲-Fe2+被·OH氧化为邻二氮菲-Fe3+，其536 nm处吸收峰消失，因此测定此处吸收值的变化可间接得知·OH的变化情况。
1.2 溶液的配制
多糖样品溶液的配制
取藤三七多糖4 mg，置于10 mL量瓶中，用水定容至刻度，备用。
0.75 mmol·L-1邻二氮菲溶液的配制
取200 mg邻二氮菲，加无水乙醇使溶解成20 mL，取此溶液3.75 mL，用蒸馏水稀释至250 mL，摇匀，即得。
150 mmol·L-1 pH值7.4 PBS溶液的配制
甲液：取7.164 g Na2HPO4·12 H2O，加水溶解，并稀释至100 mL。乙液：取3.12 gNaH2PO4·2 H2O，加水溶解，并稀释至100 mL。取上述甲液81 mL与乙液19 mL混合，摇匀，稀释至150 mL，即得。
1.3 样品的测定
将各多糖样品配成浓度为4 mg·mL-1的溶液。取6支试管，分别加入0.75 mmol·L-1邻二氮菲溶液1 mL，150 mmol·mL-1 pH 7.4 PBS 1.5 mL，充分混匀后，加入0.75 mmol·L-1 FeSO4溶液1 mL，每加1管立即混匀，然后向其中一管加入0.01 %H2O2 1 mL（损伤），另一管不加H2O2（未损伤），以蒸馏水补充体积，37 ℃保温60 min后，以磷酸盐缓冲液为参比，分别测536 nm时吸收值，得A损伤与A未损伤。其余4管分别加入一定的各多糖溶液（每次所加的体积不同），混匀，再分别加入0.01 %H2O2 1 mL，37 ℃保温60 min后以同浓度的多糖液作参比，测536 nm时的吸收值，即得A样。重复5次，以下式计算·OH清除率：
·OH清除率（S%）= （A样－A损伤 ）/（A未损伤-A损伤）×100%
Tab 1 Sample and solvent adding table
试剂 | 损伤管(mL) | 未损伤管(mL) | 加样管(mL) |
150 mmol·mL-1 pH值7.4 PBS溶液 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
0.75 mmol·L-1 邻二氮菲溶液 | 1 | 1 | 1 |
0.75 mmol·L-1 FeSO4溶液 | 1 | 1 | 1 |
0.01%H2O2溶液 | 1 | - | 1 |
在本实验条件下，藤三七多糖对·OH清除率的结果见图1。
Fig 1 Scavenging capacities of polysaccharide on ·OH(%)
从图1可以看出，藤三七多糖对H2O2/Fe2+体系产生的·OH具有清除作用，且随着藤三七多糖加入量的增加，清除率上升，即清除率与多糖的用量存在一定的量效关系，最大清除率可达到43.83%。
2 藤三七多糖对O2-·清除率的测定（邻苯三酚自氧化法）
2.1 邻苯三酚自氧化法反应体系原理
在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,生成O2-·和有色中间产物,该有色物质在 325 nm处有一特征吸收峰。当加入清除剂时,O2-·的生成受到抑制,邻苯三酚的自氧化反应受阻,溶液在 325 nm处的吸光度减小。故通过测定A325值可以定量计算出清除剂的清除率。
2.2 邻苯三酚自氧化速率测定
取4.5 mL pH8.2 50 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液，1.2 mL蒸馏水，混匀后加入25℃预热过的邻苯三酚0.3 mL（以10 mmol·L-1 HCl配制，空白管用10 mmol·L-1 HCl代替邻苯三酚的HCl溶液），迅速摇匀后倒入比色杯，325 nm下每隔30 s测定吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加ΔA0。
Tab 2 Sample and solvent adding table
试剂 |
空白管(mL) |
自氧化管(mL) |
pH8.2、50mmol·L-1
Tris-HCl |
4.5 |
4.5 |
10 mmol·L-1 盐酸 |
0.3 |
- |
50 mmol·L-1邻苯三酚 |
- |
0.3 |
H2O | 1.2 | 1.2 |
2.3 样品的测定
取藤三七多糖4 mg，精密称定，以蒸馏水溶解定容至10 mL量瓶中，在加入邻苯三酚前，先加入一定体积的多糖溶液，蒸馏水减少，然后按下述方法计算清除率。
清除率（%）=（△Ao―△A）/（△Ao）×100%
其中：△Ao为邻苯三酚自氧化速率，△A为加入多糖溶液后邻苯三酚的自氧化速率，单位均为吸光度每分钟的增加值。
Tab 3 Sample and solvent adding table
试剂 | 样品空白管(mL) | 样品管(mL) |
pH8.2、50mmol·L-1 Tris-HCl | 4.5 | 4.5 |
10 mmol·L-1 盐酸 | 0.3 | - |
H2O | 0.7 | 0.7 |
50 mmol·L-1邻苯三酚 | - | 0.3 |
在本实验条件下，藤三七多糖对O2-·的清除率结果见图2。
Fig 2 Scavenging capacities of polysaccharide on O2-·(%)
由图2可以看出，藤三七多糖对邻苯三酚自氧化过程中产生的O2-·具有一定的抑制作用，并且随藤三七多糖用量的增加其消除率逐渐上升，具有一定的量效关系，最大清除率可达到35.42 %。
5.3 小结
试验证明藤三七多糖在一定的浓度范围内，对羟自由基有较好的清除作用，并且随着多糖浓度的增加，对羟自由基的清除作用增强，且呈明显的量效关系；对超氧阴离子自由基也有清除作用，且亦呈明显的量效关系。
邻苯三酚自氧化试验检测波长的选择 邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，在自氧化过程中产生超氧阴离子，超氧阴离子又加速邻苯三酚的自氧化速率，同时产生有色中间产物，根据邻苯三酚自氧化速率测定方法，采用紫外分光光度计在190 nm~700 nm范围内进行全波长扫描，结果表明325 nm处有强烈吸收，变化显著，并且样品无干扰，因此检测波长测定为325 nm。
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