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【我们不一YOUNG】微生物检验方法标准解读（大肠菌群）

城头变幻大王骑

2024/07/28

食品毒素/微生物检测

·大肠菌群:在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。包括肠杆菌科的埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属。

·大肠菌群与肠道致病菌的来源相同，在外界中的生存力接近，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行，因此可作为水、土壤、乳品、食品饮料等被粪便污染的间接指标。

·大肠埃希氏菌

·大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli) 革兰氏阴性短杆菌，大小0.5x1~3微米。周生鞭毛，能运动，无芽跑。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，几乎占粪便干重的1/3.

01
样品稀释

固体和半固体样品:

·称取25g样品,放入盛有225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 ,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。

液体样品:

·以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。

·用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。

·根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。

02
初发酵

每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料 LST肉汤),36 ℃± 1 ℃ 培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

03
复发酵试验

用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中, 36 ℃±1 ℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。

04
结果报告

按3确证的大肠菌群 BGLB阳性管数,检索 MPN 表(见附录 B),报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN值。

01
样品稀释

·制备1:10样品匀液

以无菌操作将检样25g(mL)放于含有225mI.灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1 : 10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000 r/min~10 000 r/min的速度处理1 min,做成1 : 10的均匀稀释液。

·制备1:100样品匀液

用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL,注入盛有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管中，振摇试管混合均匀，制成1:100的样品匀液。

·制备10倍品匀液

领取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。

·移取样品

根据食品卫生标准要求或对样品污染情况的估计,选择三个稀释度，每个稀释度接种三。

02
乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lmL及以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置36 ℃± 1 ℃培养24 h±2 h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

03
分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36 ℃± 1 ℃温箱内，培养18h~ 24h,然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。

伊红美蓝琼脂:伊红Y和美蓝抑制绝大部分革兰氏阳性菌的生长.伊红Y为酸性染料，美蓝为碱性染料，琼脂是凝固剂。大肠菌群发酵乳糖产酸时，细菌带正电荷，所以染上伊红(红色)，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，大部分有金属光泽。

03
证实试验

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1- 2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36 ℃± 1 ℃培养24 h±2h,观察产气情况，凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

04
报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL (g)大肠菌群的MPN值。（转自检验检测技术运营）

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燕子

第1楼2024/08/28

作业指导书，学到了。

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