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【“仪”起享奥运】微生物无菌操作注意事项

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2024/08/10

食品常规理化分析

实验操作台面

在生物安全柜内进行微生物培养操作，操作台面的使用有以下注意事项：

用之前，无论上一个使用者是否有擦拭桌面，你都需要重新擦拭一次，并使用70%乙醇消毒台面，再使用紫外照射消毒30分钟以上；

操作台面内只放和本次实验操作有关系的实验工具，放置时按照分类和使用习惯来合理放置，切勿堆放在一起，也不要太靠近外部边缘；

实验过程中，如果培养瓶、培养皿、多孔板已打开盖子，那么手部和任何其他物品都不应该越过敞口上方，否则将可能把微生物带入器皿内；

所有的实验操作，都应该在你的视野范围内进行，也就是你在操作时，必须能看到实验工具的整体，这是为了避免因盲区导致的实验工具的末端触碰到其他物品、台面或你的身体部位，导致污染；

在实验过程中，如果出现试剂、培养物液体滴在台面，应停止当前操作，并立即用70%乙醇擦拭台面；

实验结束后，所有实验物品都应搬离台面，并再次擦拭清洁，最后用70%乙醇消毒。

操作时

进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。

同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。

工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。操作前用酒精擦拭超净台面及双手。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。

培养前准备

在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所（培养室、超净台）内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后．囚物品不全往返拿取而增加污染机会。

操作也消毒

无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次（拖布要专用）．紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线淌毒30min。

在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置．否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室。若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而．为在一切操作中为最大可能的保证无菌．每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。

洗手和着装

穿实验服、佩戴口罩和灭菌手套，长头发的同学应把头发扎在脑后，佩戴的手套的上缘应该与实验服的袖口重叠在一起，就是把袖口末端塞进手套内，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。

如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。

火焰消毒

灼烧是一种可以去除颗粒性灰尘或棉绒的有效办法，火焰也会造成附近的气流上升，避免灰尘沉降。

在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。

开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。

但是，在生物安全柜内，点燃酒精灯进行灼烧是不合适的。

生物安全柜工作时，会为内部空间提供一个稳定的层流，但酒精灯的火焰会对它产生干扰，进而影响内部的无菌环境，提高了生物污染的风险。

移液

对于小体积移液，一般特指小于1mL的液体转移，因为其体积小，通常需要使用移液器来操作。

而小体积的移液吸头比较短，在吸液的过程中有可能出现移液器下端也进入瓶皿内部的情况。

此时就需要特别注意，不能让移液器碰触到瓶皿内壁，如果碰触了，则应该立即使用70%乙醇清洁移液器下端，然后才可以继续往下进行实验操作。

对于大体积移液，例如5/10/25mL或以上的液体转移，可以用大量程的移液吸头或大量程的电动移液器辅助移液。

但不管是什么体积的移液，都应该确保吸头或移液管的末端内是含有棉花或透气胶塞的，这样可以有效避免因为移液过程中，液体吸入移液器内部造成污染。

但由于大体积移液的液体转移速度快、量大，有时候即使有棉花，也会出现液体被吸入移液器内的现象，这时就只能停止实验，或改用其他未被污染的移液器来操作了。

关于溶液倾倒，有时液体的转移不需要特别精准，会把溶液从一个瓶内直接倒入另一个瓶内或管内。

在操作时，需要注意溶液从原来的容器中倒入新的容器时，瓶口应保持悬空，而不是直接接触新容器的瓶口边缘来完成液体转移。

因为后者会容易出现液桥，即液体在两个挨得很近的接触面之间形成的水柱，这样的水柱容易被微生物进入；同时，在倾倒的时候也要注意不要让液体流淌在容器的外表面，因为这样也会提高微生物污染的风险。

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