仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯
立即体验
APP内打开
回版面
评论
收藏
点赞
拍砖
举报
取消
发布
当前位置:
仪器社区
>
食品检测
>
食品常规理化分析
>
帖子详情
【“仪”起享奥运】WB实验中配胶与电泳阶段注意事项
Ins_f12036f2
2024/08/10
私聊
食品常规理化分析
蛋白质免疫印迹法是基于蛋白质SDS-PAGE电泳分离和特异性抗体识别蛋白的特性,通过显色技术,以达到检测目的蛋白的技术。该技术广泛应用于定性检测蛋白水平的表达,活性分析与鉴定。
该实验步骤多,关键点多,耗时长,每个步骤可能都影响最终的结果,所以实验中经常出现各种问题。笔者根据个人实际实验操作中遇到的问题将从WB的配胶和电泳阶段分析问题原因或给出解决方法。
一、配胶阶段注意事项
1、配胶试剂管理:
应确保所使用的配胶试剂在有效期内,且试剂需清澈透明。若发现有沉淀或结晶产生,应及时进行更换。
2. pH 8.8的Tris-HCl和pH 6.8的Tris-HCl可能会出现沉淀,因此需根据需要选择合适的浓度(1.0M或1.5M)。同时,10%的SDS在低温(4℃以下)存放时容易结晶,而30%的丙烯酰胺则需要在避光且低温(4℃以下)的条件下保存。
APS(过硫酸铵)活性较强,室温下容易失效,建议进行分装后冷冻保存于-20℃。由于TEMED(四甲基乙二胺)挥发性强且有毒,因此需要在通风条件良好的环境下使用,避免长时间直接暴露在空气中。
操作技巧:
1. 在插入梳子时,应采用斜插的方式,以有效避免气泡的产生。
2. 为了防止胶条老化和干燥,电泳结束后,应将胶条置于实验台上晾干。如果胶条出现裂纹,可以使用保鲜膜进行覆盖,这样不仅可以防止胶液泄漏,还能延缓胶条的老化。
3. 最佳的操作方法是现配现用胶。如果需要保存,可以使用湿润的保鲜膜将胶包好,并放置在4℃的冰箱中。
常见问题分析:
1.漏胶问题:
原因分析:漏胶通常由于玻璃板未对齐、底部缺损、厚玻璃板边条密闭性不佳或塑料夹子过松所导致。
解决方法:在操作前,务必确保玻璃板干燥,以防潮湿影响对齐。在对齐玻璃板时,应使用一手的食指按压厚玻璃板的一侧上缘,同时用拇指按压薄玻璃板的同侧上缘,然后同时向下按压并锁定该侧的锁扣。接着,重复此步骤以锁定另一侧,确保玻璃板紧密对齐。
2.胶体未凝固:
原因分析:胶体未能凝固可能是由于APS或TEMED失效,或者在胶体未完全凝固时对其进行了移动。
解决方法:在制备胶体前,确认所有试剂的有效性,并严格按照正确的配比进行混合。如果配比无误但胶体仍未凝固,可以尝试增加凝固剂的用量或延长凝固时间。
3.胶体中存在气泡:
情况一:胶底部出现气泡,可能是胶垫材质或梳子插入不当所致。可改用实心软胶垫或添加保鲜膜。
情况二:梳子下缘出现气泡,解决方法是先插入一侧梳子再插另一侧。
4.拔梳子后泳道有胶丝:
原因分析:此问题通常是由于TEMED用量过多,导致胶体凝固过快。
解决方法:在制备胶体时,适当减少TEMED的用量。
5.拔梳子后泳道歪斜:
原因分析:泳道歪斜往往是由于梳子与玻璃板不匹配所致。
解决方法:在灌胶之前,务必先测试梳子与玻璃板的匹配度,确保它们能够紧密贴合。
二、电泳阶段注意事项
电泳操作要点:
1.确保上样一致性:
在进行上样时,必须确保每个加样孔的上样体积保持一致,这样可以避免蛋白条带出现水平不齐的情况。对于空置的加样孔,需要添加与样品等体积的1×loading buffer,以防止相邻通道的蛋白样品发生扩散。同时,上样时应缓慢添加样品,避免快速吹打导致样品溢出,且上样体积应控制在加样孔总容积之内。
2.电泳液的使用:
内槽需要被电泳液填满,而外槽则只需填至1/4处。对于不同厚度的玻璃板,上样量也有所不同。例如,1.0mm厚的玻璃板每孔最多可以上样20μL,而1.5mm厚的玻璃板每孔则可以上样40μL。
3.合理设置电压:
电压的设置需要根据环境温度来调整。在夏季室温较高时,应适当降低电压;而在冬季则可以提高电压。分离胶的固定电压应设为150V。在调节电压时间时,可以参考marker的位置。当marker分开时,表示蛋白已经进入分离胶。此外,在夏季高温时,可以将电泳槽放入冰水中进行降温,以防止凝胶发生变形。
4.常见问题分析:
1.电泳带扭曲或歪斜:
原因分析:这种情况通常是由于电泳液未加足够或发生漏液所导致。
解决方法:在电泳过程中,要及时检查和补充电泳液,以确保电泳槽内的液体保持足够的量,从而逐渐纠正电泳带的走向。
2.电泳带出现拖尾现象:
原因分析:拖尾现象往往是因为样本未能充分溶解。
解决方法:在进行上样前,务必确保样本已经完全溶解,这样可以有效减少拖尾现象的发生。
3.电泳带向两侧过度扩散:
原因分析:扩散过度通常是由于上样量过多所引起。
解决方法:应当适当减少上样量,以控制电泳带的扩散范围,保持电泳带的清晰度。
4.溴酚蓝呈笑脸状:
原因分析:当制胶试剂温度过高或制胶后未能及时保湿时,可能导致胶层不均匀,从而使得溴酚蓝呈现特殊的笑脸形状。
解决方法:在进行电泳时,应降低电压并调节电泳速度,同时确保电泳过程在冰浴条件下进行,以减少胶层不均匀的情况。
5.电泳条带不整齐:
原因分析:条带不整齐可能由于胶凝固不均匀、胶的下边缘存在气泡、上样buffer浓度不准确或在拔梳子时操作不当所导致。
解决方法:应等待胶完全凝固后再进行上样,以确保实验结果的最佳性;电泳前需仔细检查并清除胶底部的气泡;重新配置适宜浓度的上样buffer;在拔梳子时,应水平且缓慢地进行,以确保样品孔的均匀性。
6.电泳条带过粗:
原因分析:条带过粗可能是由于上样量过大、浓缩胶未能有效浓缩、浓缩胶的pH值不准确或电压过高所导致。
解决方法:应适量减少上样量;考虑增加浓缩胶的长度以提高浓缩效果;确保浓缩胶的pH值调整至正确的6.8;同时,适当降低电泳的电压。
通过严格遵守上述电泳阶段的注意事项,并不断优化实验流程,可以有效提升Western Blot实验的成功率,并确保实验数据的准确性和可靠性。
相关话题
1
【“仪”起享奥运】食品中过氧化值需要用到哪些仪器设备
2
【“仪”起享奥运】标准样品的稳定性如何判断
3
【“仪”起享奥运】保留时间正常,峰面积逐渐减少,什么原因?
4
【“仪”起享奥运】教你如何进行氢氧化钠溶液的标定!
5
【“仪”起享奥运】校准确认之后要留下哪些记录?
近期热榜
【官方邀请】高效液相色谱使用情况有奖调研
【中秋佳节】 在一起月更圆!
一个“不符合”难住新领导
第三届微课大赛投票进行中ing
热门活动
第三届微课大赛投票进行中ing
【仪采通】仪器采购更轻松
猜你喜欢
最新推荐
热门推荐
更多推荐
微生物的基础知识
讨论
2014/11/29
【求助】大家都用什么样的生化培养箱?
2007/06/05
【GB/T 5009-2003 食品卫生检验方法答疑活动一】GB/T 5009.3-2003 食品中水分的测定
2009/04/24
地沟油检测信息汇总:探索地沟油检测方法,为吃到安全放心油而努力!(内容不断更新中……)
分享
2011/11/07
【“仪”起享奥运】农药残留快速检测样品前处理技术汇总
分享
2024/08/11
“食品快检”虽便捷,检测结果别较真——9月加2钻石币
讨论
2015/09/07
【金秋计划】如何确保你的pH测量始终处于良好状态
分享
2024/09/13
学习一下新闻
讨论
2022/04/08
二硫化碳的测定曲线怎么做的二乙胺法求大佬指点
讨论
2024/09/14
【金秋计划】样品分离技术都有哪几种
分享
2024/09/13
【金秋计划】分光光度计的吸光度,为何要控制在1以内
分享
2024/09/13
【金秋计划】如何确保你的pH测量始终处于良好状态
分享
2024/09/13
【金秋计划】农残检测前处理方法你选对了吗
分享
2024/09/13
【金秋计划】如何搞定食品留样问题
分享
2024/09/13
【金秋计划】认可与检验检测监督管理司关于实验室一些典型问题的权威回复
分享
2024/09/12
【金秋计划】无菌室的洁净度检测方法与步骤
分享
2024/09/12
赛默飞气相TRACE1300 FPD检测器上出现结晶颗粒物是怎么原因?
求助
2024/09/10
【金秋计划】当没有合适的基质时可以用标准加入法来试试看
第十七届原创
2024/09/13
维氏硬度计的日常检查如何获得压痕参考值?
求助
2024/09/10
原子吸收火焰法测定土壤中六价铬所用质控样值一直在衰减
求助
2024/09/12
数据和结果
求助
2024/09/11
基线(随机出现)突跃有哪些原因?
求助
2024/09/12
液质有什么好项目可以做
讨论
2024/09/11
关气瓶是先关总阀还是先关减压阀?
求助
2024/09/14
【“仪”起享奥运】标准曲线绘制注意事项
分享
2024/08/10
【“仪”起享奥运】100万!新型生物材料与高端医疗器械广东研究院实验室试剂耗材采购项目
求购
2024/08/10
不止七夕 还有朝夕
原创
2024/08/10
生黄芪与山药煎水作用
原创
2024/08/10
求珀金埃尔默(Perkin Elmer)的lambda 45紫外分光光度计软件
已应助
2024/08/10
【“仪”起享奥运】原料葡萄干霉菌超标怎么办?
分享
2024/08/10
某个地方质检站要求我们出具的报告上附原始记录,回复他原始记录是技术秘密不外带,还有种哪些条例或者通知上有更详细的解读吗?
讨论
2024/08/10
【“仪”起享奥运】乳制品生产管道CIP快速清洗消毒的方法:
分享
2024/08/10
品牌合作伙伴
研究月球土壤岛津助力郑大用户登Nature顶刊
岛津
日立科学仪器
珀金埃尔默仪器(上海)有限公司(PerkinElmer)
日本电子株式会社
丹纳赫
安捷伦
赛默飞世尔科技
普析通用
欧波同
天美
天瑞仪器
德国耶拿
海能技术
马尔文帕纳科
磐诺科技
上海仪电科仪
梅特勒托利多
聚光科技
莱伯泰科
盛瀚
多宁生物
丹东百特
科哲
卓立汉光
屹尧科技
华谱科仪
宝德仪器
优莱博
HORIBA
布鲁克核磁
举报帖子
执行举报
点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...