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【“仪”起享奥运】微生物作业指导书
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2024/08/10
私聊
食品常规理化分析
(一)样品的采集
1.采样目的
确保采集的样品能代表全部被检验的物质,使检验分析更具代表性。
2.采样原则
采集的样品要有代表性,采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查,检查是否有污染源存在,同时能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。
应设法保持样品原有微生物状况,在进行检验前不得污染,不发生变化。
采样必须遵循无菌操作程,容器必须灭菌,避免环境中微生物污染,容器不得使用
煤酚皂溶液
,新洁尔灭、酒精等消毒物灭菌,更不能含有此类消毒药物,以避免杀掉样品中的微生物,所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可使用。
3.采样数量
取样数量的确定,应考虑分析项目的要求、分析方法的要求及被检物的均匀程度三个因素。样品应一式两份,分别供检验、复检使用,每份样品数量一般不少于
200g。
根据不同种类采样数量略有不同,实验室检验样品一般为
25克。
4.采样方法
采取随机抽样的方式。
直接食用的小包装食品,尽可能取原包装,直到检验前不要开封,以防污染。
如为非冷藏易腐食品,应迅速将所采样品冷却至
0-4℃。
不要使样品过度潮湿,以防食品中固有的细菌增殖。
在将冷冻食品送到实验室前,要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦融化,不可使其再冻,保持冷却即可。
5.样品的保存和运送
样品采集完后,应迅速送往实验室检验,送检过程中一般不超过
3h,如路程较远,可保存在1-5℃环境中,如需冷冻者,则在冷冻状态下送检。
冷冻样品应存放在-
15℃以下冰箱内;冷却和易腐食品应存放在0-5℃冰箱或冷却库内;其它食品可放在常温冷暗处。
运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。
待检样品存放时间一般不应超过
36小时。
(二)检验样品的制备
样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
检验冷冻样品前应先使其融化。可在
0-4℃融化,时间不超过18小时,也可在温度不超过45℃的环境中融化,时间不超过15分钟。
检验液体或半固体样品前应先将其充分摇匀。如容器已装满,可迅速翻转
25次;如未装满,可于7s内以30cm的幅度摇动25次。从混样到检验间隔时间不应超过3分钟。
开启样品包装前,先将表面擦干净,然后用
75%乙醇消毒开启部位及其周围。
非粘性液体样品可用吸管吸取一定量,然后加入适量的稀释液或培养基内,吸管插入样品内的深度不应超过
2.5cm,也不得将吸有样品的吸管浸入稀释液或培养基内。
粘性液体样品可用灭菌容器称取一定量,然后加入适量的稀释液或培养基。
固体或半固体样品可用灭菌的均质杯称取一定量,再加适量的稀释液或培养基进行均质,从样品的均质到稀释和接种,相隔时间不应超过
15分钟,或是在无菌生理盐水里放入玻璃珠,充分振荡摇匀。
(三)检验
实验室收到样品后或是自己取样后,首先进行外观检验,及时按照国家标准检验方法进行检验,检验过程中要认真、负责,严格进行无菌操作,避免环境中微生物污染。
检验所使用的稀释液、试剂、培养基接触的一切器皿必须经过有效的灭菌。
实验室所用仪器、设备的性能应定期检查和校正。
制备试剂和培养基所用的水,应为无离子水或用玻璃器皿蒸馏的蒸馏水。
检验结束后,所有带菌的培养基、试剂、稀释液和器皿必须尽快灭菌和洗刷。清洗过的器皿不应残留洗涤剂的痕迹。
(四)检验记录和结果的报告
经检验的每份样品都应有完整的检验记录。样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验记录,以作为对结果分析、判定的依据,记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。
检验结束后,根据检验结果,及时填写检验报告书,签字并经负责人审核签字后发出。
(五)样品的微生物检验流程
(六)微生物操作注意要点
无菌操作要求
(
1)微生物实验室工作人员,必须有严格的无菌观念,许多实验要求在无菌的条件下进行,主要原因,一是防止试验操作中人为污染样品,二是保证工作人员安全,防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染;
(
2)接种细菌时必须穿工作服、带工作帽;
(
3)进行接种食品样品时,必须穿专用的工作服、帽及拖鞋,应放在无菌室缓冲间,工作前经紫外线消毒后使用;
(
4)接种食品样品时,应在进无菌室前用肥皂洗手,然后用酒精棉球将手擦干净;
(
5)进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌,打开包装未使用完的器皿,不能放置后再使用,金属用具应高压灭菌或用酒精点燃烧灼三次后使用;
(
6)从包装中取出吸管时,吸管尖部不能触及试管或平皿边;
(
7)接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作,接种细菌活样品时,吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒;
(
8)接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝,必要时还要烧到针和环与杆的连接处;
(
9)吸管吸取菌液或样品时,应用相应的吸尔球吸取,不得直接用口吸。
无菌间使用要求
(
1)无菌间应密封,不得随意打开,并设有与无菌间大小相应的缓冲间及门,另尽量设有小窗,以备进入无菌间后传递物品;
(
2)无菌间应保持清洁,工作后用巴氏消毒溶液消毒,擦拭工作台面,不得存放与试验无关的物品;
(
3)无菌间使用前后应将门关紧,打开紫外灯消毒(30W,1m)时,照射时间不少于30分钟,使用紫外灯,应注意不得直接在紫外线下操作,以免引起损伤,灯管每隔两周需用酒精球轻轻擦拭,除去上面的灰尘和油垢,以减少紫外线穿透的影响;
(
4)处理和接种食品样品时,进入无菌间操作,不得随意出入,如需要传递物品,可通过小窗传递。
消毒灭菌要求
微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等,必须经灭菌后方能使用。
(
1)灭菌前准备
①所有需经灭菌的物品首先要清洗晾干,玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密,如用金属筒应将上面气孔打开。
装培养基的三角瓶塞好棉塞,试管盖好盖,用纸包好。
(
2)装放
将物品分别包扎好,直接放入消毒筒内,物品之间不能过挤。
(
3)设备检查
①检查门的开关是否灵活,橡皮圈有无损坏,是否平整。
②压力表蒸气排尽时是否停留在零位,盖好盖,通蒸气或加热后,观察是否漏气,压力表与温度计所标示的状况是否吻合,管道有无堵塞。
③对有自动电子程序控制装置的灭菌器,使用前应检查规定的程序,是否符合于进行灭菌处理的要求。
(
4)灭菌处理
手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行:
①高压锅内加入清水(重复使用时应将水量补足,水变混浊需要更换)。
②将要灭菌的物品放入灭菌锅内,盖好盖子。
接通电源,加热,水沸腾后打开放气阀排气,直到压力表指针降到
0.05Mpa时,关掉放气阀。
指针指到
121℃时开始计时,达到要求的灭菌时间关掉开关,冷却直到压力降到0.05Mpa即可通过放气阀缓慢放气。
(
5)灭菌温度与时间
①不同类型培养基的灭菌温度与时间的关系见下表:
②灭菌处理:灭菌后物品,按正常情况已属无菌,从灭菌器中取出应仔细检查,以免再度污染。
物品取出,随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉,不可作为无菌物品使用。
取出的物品,如外包装有明显的水浸者,不可作为无菌物品使用。
培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。
取出的物品掉落在地或误放不洁之处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使用。
取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。
凡属合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。
每批灭菌处理完成后,记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。
(
6)有毒有菌污物处理要求
微生物实验室所用实验器材、培养物等未经消毒处理,一律不得带出实验室。
经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内,并集中存放在指定地点,待统一进行高压灭菌。
经微生物污染的培养物,必须经
121℃,30min高压灭菌。
染菌后的吸管,使用后放入
5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中,最少浸泡24小时,再经121℃,30min高压灭菌。
涂片染色冲洗片的液体,一般可直接冲入下水道,染色的玻片放入
5%煤酚皂液中浸泡24h后,煮沸洗涤。
打碎的培养物,立即用
5%煤酚皂液或石炭酸喷洒和浸泡被污染部位,浸泡半小时后再擦拭干净。
(
7)玻璃器皿的清洗要求
①目的
为了保证微生物实验顺利进行,保证实验结果的准确性,不影响实验进度,必须把器皿彻底清洗干净。
②注意事项
任何洗涤方法,都不应对玻璃器皿有所损伤,不能用有腐蚀作用的化学药剂,也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品来擦拭玻璃器皿。
一般新的玻璃器皿用
2%的盐酸液浸泡数小时,后用水冲洗干净。
用过的器皿应立即洗涤,放置太久会增加洗涤困难。
强酸、强碱及其它氧化物和有挥发性的有毒物品,都不能倒在洗涤槽内,以免污染环境水质,必须倒在废水缸中。
含有对人体有传染性病菌的器具,应先煮沸灭菌后再进行洗涤。
难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起,以免增加洗涤的麻烦。有油的器皿不要与无油的器皿混在一起,否则使本来无油的器皿沾上了油垢,浪费药剂和时间。
洗涤剂的种类:水、洗衣粉、柠檬洗涤剂、肥皂。
③洗涤方法
含有琼脂培养基的玻璃器皿的洗涤方法:事先应将器皿中的琼脂刮去,然后用清水洗涤,并用试管刷刷其瓶壁,以除去粘污在壁上的灰尘和油垢。用洗衣粉水洗去油污,然后用自来水(蒸馏水)冲洗。洗好后的器皿应倒置晾干或置于干燥箱中干燥至无水滴。
载玻片及盖玻片的洗涤法:新载玻片及盖玻片先在
20%的盐酸溶液中浸一小时,然后用自来水冲洗2~3次,最后用蒸馏水换洗2~3次。用过的载玻片及盖玻片,应用纸擦去油垢,再放在5%的洗衣粉水中煮30分钟后立即用自来水冲洗,然后放在稀的洗液中浸泡2小时,再用蒸馏水冲洗至中性。
移液管、倒管的洗涤方法:新的移液管及倒管先在的5%盐酸溶液中浸一小时,然后用自来水冲洗几次,最后用蒸馏水换洗几次。用过的移液管、倒管先用自来水洗去表面的残液,再放在洗衣粉水中浸泡一小时以上,再用自来水冲洗至管内壁无残渣,最后用蒸馏水换洗次,晾干后入恒温干燥箱中烘干。
(
8)培养基、无菌水的制备
①基本原理
培养基的种类很多,不同微生物所需要的培养基不同。培养基制成后的物理状态可分为液体、固体、半固体三种类型,我们实验室常用的是
固体培养基
。
②器材
三角瓶、试管、烧杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、铝箔纸、药勺、杜氏小管、硅胶塞(棉塞)、电炉。
培养基的种类
营养琼脂培养基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰琼脂培养基等。
方法步骤
培养基的制备:
称量:根据培养基的配方,称取适量药品于搪瓷杯中。
溶解:用量筒量取所需水量,置电炉上加热,一边搅拌,至完全溶解,加热至沸腾,拔掉电源,待冷却。
分装:根据不同需要,立即趁热分装入三角瓶或试管中,分装三角瓶以不超过三角瓶一半为宜,分装试管一般为管长的
1/5(需根据试管的大小而定)。液体培养基如乳糖胆盐
发酵培养基
约分装10毫升左右。
塞橡胶(棉)塞:装好培养基的试管应塞上橡胶(棉)塞,松紧合适,紧贴管壁,不留缝隙,约
1/2塞入内,这样即可过滤空气,避免杂菌侵入,又可减缓培养基水分的蒸发。
包装:三角瓶棉塞头部应用锡箔纸包扎,试管集中于试管篓。
无菌水的制备:
用
10mL移液管量取9.0mL蒸馏水(稀释水)装入试管中。
用
250mL量筒量取225mL蒸馏水(稀释水)装入250mL的三角瓶中,可置少许玻璃珠于三角瓶内,塞上橡胶(棉)塞用牛皮纸包扎好,高压灭菌备用。
(
9)设备使用原则
①实验设备的使用由实验员严格按照操作说明书进行,其他人员不得随意操作。
②实验设备的日常维护保养由实验员根据设备操作说明书进行,出现不可排除的故障时,经部门总经理批准,商请专业人员维修。
③实验设备应定期进行计量检测,确保仪器的准确性。
④实验员应爱护仪器设备,使用前应检查,使用后应及时清理清洁,并定期维护保养,下班前应检查设备电源是否关闭。
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