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【“仪”起享奥运】金黄色葡萄球菌检测，不看就out了

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2024/08/10

食品常规理化分析

金黄色葡萄球菌

第一法金黄色葡萄球菌定性检验
01
操作步骤

·样品的处理

称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~ 2min。若样品为液态,吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀。

·增菌

将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18h~24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。

·分离

将增菌后的培养物,分别划线接种到 Baird-Parker平板和血平板,血平板36 ℃±1 ℃培养18h~ 24h。Baird-Parker平板36 ℃±1 ℃培养24h~48h。

·初步鉴定

金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2mm~3mm, 颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些, 且外观可能较粗糙,质地较干燥。

在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述可疑菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

·确证鉴定

1.染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为 0.5μm~1 5 μm。

2.血浆凝固酶试验:挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5个可疑菌落(小于5个全选),分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面,36 ℃±1 ℃培养18h~24h。

取新鲜配制兔血浆0.5 mL,放入小试管中,再加入 BHI培养物0.2 mL~0.3 mL,振荡摇匀,置 36 ℃±1 ℃温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验。结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBHI,36 ℃±1 ℃培养18h~48h,重复试验。

02
结果报告

结果判定:符合4、5,可判定为金黄色葡萄球菌。

结果报告：在25g(mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。

03
注意要点

1.7.5%氯化钠肉汤增菌培养：

（1）若样品本身在均质后清澈，培养18h观察呈现一定程度的浑浊（与培养前相比），则接种平板；若18h后仍无变化，继续培养至24h后无论浑浊与否都接种至平板；

（2）若样品本身在均质后浑浊，则直接培养至24h后再接种平板。

2.血平板：36±1℃培养18h后观察，若有菌落生长或有菌落生长的迹象（无论是否溶血），则应酌情配制NA、BHI并分装至小试管中（NA 10mL/管、BHI 5mL/管）、灭菌后NA应斜放凝固成琼脂斜面备用。至血平板培养至24h取出，挑取菌落进行革兰氏染色镜检，同时挑取菌落接种至NA斜面、BHI肉汤管，36±1℃培养24h。

3.接种原则：

（1）革兰氏染色后还剩余10个或10个以上菌落，则NA、BHI分别接种5管；

（2）若多于5个（不包括5个）不足10个，则BHI接种5管，剩余的接种NA；

（3）5个及以下则全部接种BHI，不接种NA。

4.BP平板：

36±1℃培养24h后观察，有菌落生长则取出，无菌落生长则继续培养至48h后再观察。若血平板已挑取菌落进行证实试验，则不必再挑取BP平板上的菌落进行实验。若血平板上无菌落生长，则应在24h～48h内逐步观察BP平板是否长菌或有无长菌迹象，有则需配置BHI及NA，挑取BP上的菌落进行纯化、增菌，36±1℃培养24h。

5.血浆凝固酶试验：

（1）根据BHI管数，取冻干血浆粉，每瓶用移液枪加入0.5mL生理盐水，使其充分溶解，再换移液枪枪头取0.3mLBHI培养物加入其中（每管BHI用1个枪头），振荡摇匀后于36±1℃培养，计时，每30min观察一次，如呈现凝固（将试管倾斜或倒置时出现凝块）或半凝固（一般的液体呈现凝固）则判定为阳性。若一直不凝固，则一直观察，直至观察至6h（查看12次）还未凝固，则试验终止，判定为阴性结果；若中途出现完全凝固或半凝固，则试验终止，判定为阳性结果。

（2）同时取金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 6538以及CMCC（B）26003各一支）制成菌悬液后作为阳性对照、以灭菌生理盐水为阴性对照，分别接种至BHI中同步培养后进行血浆凝固酶试验。

（3）若血浆凝固酶试验结果可疑，则挑取NA上的菌落接种BHI再次进行试验。

第二法金黄色葡萄球菌平板计数法

01
操作步骤

·样品的稀释

1.固体和半固体样品:称取25g样品置于盛有225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。

2.液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。

3.用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL 无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。

4.按3操作程序,制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用1次1mL无菌吸管或吸头。

·样品的接种

根据对样品污染状况的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别加入三块 Baird-Parker平板,然后用无菌涂布棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如 Baird-Parker平板表面有水珠,可放在25 ℃~50 ℃的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。

·培养

培养在通常情况下,涂布后,将平板静置10min,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36 ℃±1 ℃培养1h;等样品匀液吸收后翻转平板,倒置后于36 ℃±1 ℃培养24h~48h。

·典型菌落计数和确认

1.金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为 2 mm~ 3mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。

2.选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU~ 200CFU 之间的平板,计数典型菌落数。

3.从典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验。分别做染色镜检,血浆凝固酶试验;同时划线接种到血平板36℃±1℃培养18h~24h后观察菌落形态,金黄色葡萄球菌菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。

02
结果计数

1.若只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU~200CFU 之间,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。

2.若最低稀释度平板的典型菌落数小于20CFU,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。

3.若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU,但下一稀释度平板上没有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。

4.若某一稀释度平板的典型菌落数大于200CFU,而下一稀释度平板上虽有典型菌落但不在20CFU~200CFU 范围内,应计数该稀释度平板上的典型菌落,按式(1)计算。

5. 若2个连续稀释度的平板典型菌落数均在20CFU~200CFU 之间,按式(2)计算。

计算公式

03
结果报告

根据上面的公式计算结果,报告每g(mL)样品中金黄色葡萄球菌数,以 CFU/g(mL)表示;如T 值为 0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

04
注意要点

1.取1mL样品稀释匀液接种3个BP平板（此处并未严格按照标准中0.3mL、0.3mL、0.4mL精确取样，由于如此操作会增加试验时间，无法在15min内完成试验）。

2.涂布时不要触及平板边缘（会导致样液涂抹不均匀，大部分汇集于边缘）。

3.可用同一根涂布棒从低稀释度到高稀释度进行涂布（不用换涂布棒）。

4.涂布完成后应稍微放置一段时间使培养基吸收样品匀液。

5.若水珠较多，可正置于培养箱中1～2h后再倒置培养。

6.36±1℃培养24h后观察，有典型菌落生长则进行证实试验（革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验、划线血平板）。若无菌落生长则继续培养至48h后再观察，有典型菌落生长则进行证实试验，无典型菌落生长则试验终止。

第三法金黄色葡萄球菌MPN计数法

01
操作步骤

同第二法

02
接种培养

1.根据对样品污染状况的估计,选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行 10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别接种 1 mL 样品匀液至 7.5% 氯化钠肉汤管(如接种量超过 1mL,则用双料7.5%氯化钠肉汤),每个稀释度接种3管,将上述接种物36℃±1℃培养,18h~24h。

2.用接种环从培养后的7.5%氯化钠肉汤管中分别取培养物1环,移种于Baird-Parker平板36℃ ±1 ℃培养,24h~48h。

03
典型菌落确认

同第二法

04
结果报告

根据证实为金黄色葡萄球菌阳性的试管管数,查MPN检索表,报告每g(mL)样品中金黄色葡萄球菌的最可能数,以 MPN/g(mL)表示。

05
注意要点

1、样品稀释同菌落总数，取3个连续稀释度稀释液（或包括液体样品原液），每个稀释度接种3管7.5%氯化钠肉汤，每管接种1mL，36±1℃培养18h后观察，若出现浑浊则接种至BP平板，若无变化则继续培养至24h后再接种至BP平板。

2、划线接种至BP平板，36±1℃培养24h后观察，有典型菌落生长则进行证实试验（革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验、划线血平板）。若无菌落生长则继续培养至48h后再观察，有典型菌落生长则进行证实试验，无典型菌落生长则试验终止。

3、根据证实后的阳性管数差MPN表得出结果。

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