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【金秋计划】重组工程菌发酵表达
Ins_c893613c
2024/09/06
私聊
食品常规理化分析
一、准备阶段(大肠杆菌为例)
根据试验需求,准备合适的培养基,比如说
LB
,参照相关内容。
准备
移液枪
枪头,接种环,玻璃棒等。
二、种子培养阶段
1
.菌种活化:
方法参照相关内容。
2
.种子液接种:
从保存的平板上挑取单克隆至种子培养液中(
50mL/250mL
),将其放置于恒温(
37
℃
)摇床中振荡(
200rpm
)培养,过夜(
约12h
)。
三、摇瓶发酵培养阶段
1
.摇瓶接种:
将上述种子培养液按照一定比例(一般
1%
-
10%
)接种至新鲜的发酵培养基中(
100mL/500mL
)。
按照需要选择合适的三角瓶,比如说
50mL/250mL
、
100mL/500mL
,如果需要量比较小,也可以选择
5mL/50mL
,
10mL/50mL
等。
2.发酵培养:
将接种后的三角瓶放置于恒温(
37
℃
)摇床中振荡(
200rpm
)培养。
定期检测发酵生物量
摇起来有助于氧气的供应、微生物和营养物质均匀分布,使微生物更好地生长。
3.诱导阶段:
约摇瓶培养
2h左右,OD600达到0.6-0.8,此时添加诱导剂(IPTG)开始诱导,诱导目的基因表达,约5h。
一般诱导剂的浓度
0.1mM-1mM
,浓度过低过高都会影响表达效果。如果不知道多少合适,可以先选择
0.5mM进行试验,后续再进行浓度筛选。
4.发酵结束:发酵结束,离心后去上清,收集菌体。
不同的微生物,表达产物的位置不同,收集相应的菌体或上清。
5.
细胞破碎
:取一定量菌体,用PPS重悬后,使用超声破碎仪破碎。
注意破碎功率和时间,注意冰水混合液降温。(糗事:第一次破碎忘记加冰。)
6.
检测:
定性检测,定量检测蛋白浓度,还有
Western Blotting
、酶活检测等。
酶活测定可以采用
液相
、
气相
,也可以采用比色法等方法。
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