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黄芪活性成分抗结肠癌作用机制研究进展

城头变幻大王骑

2024/09/13

中药/天然药检测

结肠癌是发病率和死亡率分别位列世界第3和第2的恶性肿瘤[1-2]，临床上对结肠癌治疗主要采用放化疗和手术治疗等手段，虽然一定程度上可以遏制恶性肿瘤的发展，但也具有诱发多药耐药性、预后性差及易引起不良发应等缺点[3]。因此，针对结肠癌的新治疗方案和新药物研发显得尤为重要。中医药疗法在肿瘤治疗中积累了丰富的经验，随着我国中医药研究的不断深入发展，探索新的治疗药物和治疗方案，提高结肠癌患者的临床疗效势在必行[4-5]。中医认为结肠癌属本虚标实之证，虚以脾虚为主，多兼有痰、湿、热、瘀、毒等标实情况[6-7]。根据中医辨证论治的理论，调整人体阴阳平衡、扶正祛邪是治疗结肠癌的中医治疗方法之一。黄芪为补气药的代表药，为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus(Bge.) Hsiao或膜荚黄芪A. membranaceus (Fisch.) Bge.的干燥根，主要含有多糖类、皂苷类、黄酮类、生物碱类、氨基酸类、微量元素及有机酸类等成分[8-9]。现代药理研究表明黄芪中的多糖、皂苷类及黄酮类等活性成分可以抑制结肠癌的增殖、迁移及诱导凋亡。其中黄芪多糖、黄芪甲苷及黄酮类成分因具有较强抗肿瘤活性而被国内外研究者广泛关注[10-12]。本文通过整理国内外黄芪活性成分治疗结肠癌的研究文献，为黄芪治疗结肠癌在临床上的应用提供实验参考。
1抑制结肠癌早期炎症反应
结肠癌的发生与炎症密切相关，慢性炎性反应是炎性反应性肠病中结直肠癌的关键诱发因素，长期慢性炎症得不到有效改善，久而久之就会形成瘤块[13-14]。因此预防结肠炎症有利于预防结肠癌的发生。黄芪多糖能够提高溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）小鼠血清脂联素和血液血红蛋白水平，抑制炎症反应，减轻UC小鼠结肠组织受损，也可通过调节脂联素/Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路对UC小鼠发挥治疗作用[15-16]。黄芪多糖对UC大鼠肠黏膜具有保护作用，可显著降低超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）及谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）的活性，抑制肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）及IL-6等炎性因子的释放。其机制可能是通过调节TLR4/NF-κB信号通路，从而减轻氧化应激和炎症反应[17]。此外，黄芪多糖也可改善葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）诱导的大鼠结肠炎严重程度，其机制可能是通过抑制NF-κB在结肠组织中的激活而介导的，而NF-κB的激活反过来又可下调结肠组织的促炎反应[18]。Zhong等[19]发现黄芪多糖可调节结肠炎小鼠结肠组织炎症因子的表达，显著上调结肠炎小鼠调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）及其相关核转录因子叉头框蛋白P3（forkhead box P3，FoxP3）、细胞因子IL-10水平，进而改变T滤泡辅助（follicular helper T cell，Tfh）/Treg细胞的平衡，有效缓解结肠炎症。黄芪甲苷IV可降低UC大鼠血清D-乳酸及二胺氧化酶水平，提示黄芪甲苷IV可改善UC模型大鼠结肠黏膜通透性及黏膜屏障功能[20]。姜媛等[21]通过研究黄芪甲苷对DSS诱导的UC小鼠的保护作用，发现其可通过降低小鼠结肠固有层中Ly6C+MHC II?巨噬细胞比例及炎症因子表达，缓解UC的发生发展。Tian等[22]研究发现在DSS诱导的结肠炎中，黄芪甲苷可通过调节信号传导转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）信号通路阻断巨噬细胞的M1极化，从而降低临床疾病活性，下调促炎因子表达，上调抗炎因子表达，并降低了巨噬细胞的百分比，从而改善实验性结肠炎。Yu等[23]研究发现在DSS诱导的小鼠结肠炎中，芒柄花苷可通过激活线粒体自噬抑制NOD样受体热蛋白结构域3（NOD like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）炎性小体减轻结肠炎症，提示触发线粒体吞噬可能是一种潜在的治疗炎症性疾病的策略。综上，黄芪中的活性成分黄芪多糖、黄芪甲苷及芒柄花苷可通过调控TLR4/NF-κB、STAT1信号通路，进而调控炎症因子的表达来改善炎症水平，也可通过抗氧化应激、改变Tfh/Treg细胞的平衡、保护肠道黏膜屏障及免疫系统等方式，对结肠癌早期的炎症发挥良好的治疗作用，见图1。
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2 抗结肠癌作用机制
2.1抑制结肠癌细胞增殖
2.1.1 阻滞结肠癌细胞周期细胞周期可直接反映细胞增殖的过程，结肠癌细胞经过G1→S→G2→M细胞周期后完成其增殖。因此将结肠癌细胞阻滞在细胞周期内，可抑制结肠癌细胞增殖[24]。宋鑫等[25]通过检测不同浓度黄芪多糖对人结肠癌HT-29细胞周期的影响，发现黄芪多糖可使HT-29细胞的生长停滞在G1期。李志林等[26]经黄芪甲苷干预小鼠结肠癌CT26细胞后，利用流式细胞学检测细胞周期的分布情况，结果显示黄芪甲苷可使细胞周期停滞在G1期，且呈时间相关性。此外，细胞周期调控因子在细胞增殖中具有重要作用，其异常表达可使结肠癌细胞过度分裂与增殖[27]。Wang等[28]研究发现经黄芪甲苷处理人结肠癌SW620和HCT116细胞后，细胞周期关键相关蛋白细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和细胞周期蛋白依赖激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）的mRNA和蛋白水平显著下降，SW620和HCT116细胞在G0/G1期出现明显的细胞周期阻滞。Tin等[29]发现黄芪总皂苷通过阻滞细胞周期的S期和G2/M期，同时抑制p21表达和周期有关激酶活性，进而抑制细胞增殖。
2.1.2 抑制结肠癌细胞增殖结肠癌细胞具有无限增殖的特点，抑制其增殖是抗结肠癌的一种重要方式。研究表明，黄芪活性成分具有诱导结肠癌细胞凋亡的作用[30]。黄芪甲苷干预人结肠癌SW480细胞后，细胞增殖标志蛋白Ki67和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表达水平显著降低，从而起到抑制SW480细胞增殖的作用[31]。为进一步增强黄芪甲苷抗结肠癌的效果，庞歆桥等[32]利用黄芪甲苷联合西妥昔单抗对人结肠癌RKO细胞进行干预，结果显示黄芪甲苷与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）单克隆抗体联用对结肠癌细胞增殖有显著的抑制作用。徐明等[33]研究发现黄芪多糖对人结肠癌细胞有直接杀伤作用，且呈剂量-时间相关性。郑学芝等[34]研究黄芪多糖对人结肠癌COLO205细胞增殖的影响，发现经黄芪多糖处理后PCNA表达降低，提示黄芪多糖可抑制COLO205细胞增殖，可能与降低PCNA的表达有关。
综上，黄芪多糖、黄芪甲苷通过调控细胞周期抑制结肠癌细胞增殖主要有2种方式：（1）通过阻滞细胞周期于G1和G0/G1期；（2）通过调控细胞周期调控因子，进而阻滞细胞周期进程。其次，黄芪多糖、黄芪甲苷可通过调控多种增殖基因的表达，进而抑制结肠癌细胞增殖，发挥抗结肠癌的作用。见图2。
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2.2 诱导结肠癌细胞凋亡
细胞凋亡是由基因调控的一种自发死亡的过程，凋亡相关基因在细胞凋亡进程中具有重要作用，线粒体凋亡信号转导途径和死亡受体途径是细胞凋亡的2种途径，线粒体凋亡信号转导依赖于线粒体膜电位和通透性的变化，钙水平的持续升高导致细胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）和Omi从膜内空间转位到细胞质中[35]。Cyt-C的释放可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（cystein-asparate protease-9，Caspase-9），进而导致Caspase-3和Caspase-7的激活，诱导细胞凋亡[36]。死亡受体途径是通过受体与配体的结合来激活信号转导级联反应，一旦接收到细胞外的死亡信号，Caspase-8被激活，进而引发下游Caspase的活化，诱导细胞凋亡[37]。侯本超等[38]发现不同浓度黄芪甲苷处理HCT116细胞后，抑凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）表达量降低，促凋亡Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表达量升高。Sun等[39]研究发现黄芪甲苷可诱导Caspase依赖性凋亡，包括Cyt-C和Omi从线粒体向细胞质释放增加，Bax/Bcl-2的值上调，多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly adenosine diphosphate-ribose polymerase，PARP）和Caspase级联反应（Caspase-3和Caspase-9）激活。提示黄芪甲苷具有促进结肠癌细胞凋亡的作用，并呈剂量相关性。阎力君等[40]用不同浓度黄芪多糖干预SW620细胞，对其凋亡率进行测定，结果表明黄芪多糖给药后Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C和促凋亡基因Bax表达量增加，Caspase-9前体和抗凋亡基因Bcl-2表达降低，提示黄芪多糖具有诱导结肠癌细胞凋亡的作用，该机制可能是通过线粒体凋亡途径所实现的。李成军等[41]从自噬作用方面探讨黄芪多糖对结肠癌干细胞凋亡的影响，发现经黄芪多糖干预后，Caspase-3、Caspase-9、死亡因子（factor associated suicide，Fas）、Bax mRNA和蛋白的表达升高，Bcl-2、X连锁凋亡抑制mRNA和蛋白表达降低，提示黄芪多糖可同时诱导线粒体凋亡途径和Fas死亡受体途径的活化，促进结肠癌干细胞凋亡。综上，黄芪甲苷，黄芪多糖等可通过激活线粒体途径和激活死亡受体途径来诱导结肠癌细胞凋亡。见图3。
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2.3抑制结肠癌细胞侵袭及转移
结肠癌细胞侵袭与转移在结肠癌的发展过程中具有重要作用，抑制其侵袭与转移是结肠癌治疗方式之一，结肠癌细胞侵袭主要受侵袭基因的调控[42]。李强等[43]通过研究黄芪甲苷对结肠癌细胞的侵袭活力，结果发现黄芪甲苷处理后整合素金属蛋白酶17、基质金属蛋白酶11（matrix metalloproteinase 11，MMP11）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、锌指E盒结合同源盒蛋白2的表达显著降低，蛋白酶组织抑制因子-1、E-钙黏蛋白（E-cadherin）蛋白的表达显著增加，且呈剂量相关性，提示黄芪甲苷可通过调控侵袭基因的表达，发挥抑制结肠癌细胞侵袭的效用。王旗等[44]研究发现经黄芪多糖处理HCT116细胞24 h后，MMP2、MMP9的表达水平、细胞侵袭和迁移能力显著降低，提示黄芪多糖能够抑制HCT116细胞侵袭和迁移。此外，黄芪多糖可通过抑制NF-κB的核转位，下调N-cadherin的表达，上调E-cadherin的表达，有效抑制结肠癌细胞的上皮间质转化过程，抑制结肠癌细胞的增殖和迁移[45]。芒柄花素可下调VEGF和MMP2、MMP9蛋白等促血管生成关键因子的表达，从而抑制血管生成和结肠癌细胞侵袭[46]。综上，黄芪甲苷、黄芪多糖、芒柄花素通过抑制侵袭及黏附相关因子的表达抑制结肠癌细胞的侵袭与转移。见图4。
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2.4增强机体免疫功能
现代药理作用研究表明，黄芪具有良好的免疫调节作用，近年来，黄芪通过免疫调节发挥抗肿瘤的研究逐渐增多。黄芪甲苷与检查点抑制剂aPD-1联合具有协同抗肿瘤作用，抑制肿瘤生长，增加T细胞浸润。黄芪甲苷可诱导M2巨噬细胞向M1表型分化[47]。黄芪甲苷III通过上调自然杀伤细胞的免疫应答，增加自然杀伤细胞激活受体、Fas和γ干扰素的产生，发挥抗结肠癌作用[48]。黄芪多糖可通过蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/核糖体蛋白S6激酶β1途径下调细胞表面程序性细胞死亡蛋白配体-1的表达，在肿瘤的免疫治疗中发挥重要作用[49]。王奇钰等[50]研究表明黄芪多糖可通过参与肿瘤淋巴结的生成，抑制结肠癌淋巴转移，吲哚胺2,3-双加氧酶1的高表达与免疫细胞对肿瘤抗原免疫耐受的形成、T细胞和自然杀伤细胞功能的抑制、Treg细胞的生成和激活等有关，黄芪多糖联合5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）组CD4+ T淋巴细胞的浸润显著降低，CD8+ T淋巴细胞的浸润显著升高[51]。黄芪多糖联合新辅助化疗方法可有效降低结直肠癌患者血清外泌体表达水平，增强免疫功能，减轻化疗药物的毒性反应[52]。综上，黄芪甲苷、黄芪甲苷III、黄芪多糖及黄芪多糖联合新辅助化疗通过调控免疫细胞相关的功能，从而达到抑制结肠癌细胞生长的作用。见图5。
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2.5其他作用
黄芪活性成分也可通过防治内质网应激性肠细胞损伤、调控耐药细胞对化疗药物的敏感性等发挥抗结肠癌作用。黄芪多糖可呈剂量相关性减少葡萄糖调节蛋白78和C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白表达，提示黄芪多糖可防治内质网应激性肠细胞损伤[53]。化疗耐药是结肠癌治疗的一个难点，而黄芪多糖、黄芪甲苷可以逆转化疗药物的耐药性，黄芪多糖可通过下调miR-20a并上调转化生长因子B受体2的表达，提高人结肠癌顺铂耐药株对顺铂的敏感性，从而抑制细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡，提示黄芪多糖可调控耐药细胞对化疗药物的敏感性[54]。黄芪甲苷则通过抑制神经源性基因座notch同源蛋白3（neurogenic locus notch homolog protein 3，NOTCH3）的表达使结肠癌细胞对顺铂敏感，提示黄芪甲苷联合NOTCH3可能是治疗结直肠癌的新途径[55]。平娟等[56]通过研究黄芪多糖提高SW480细胞对5-FU的敏感性，发现黄芪多糖对5-FU抗结肠癌细胞的作用具有协同和增强作用，提示黄芪多糖可为结肠癌化疗提供辅助治疗。
3调控相关信号通路抗结肠癌作用机制
3.1调控磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt
PI3K/Akt信号通路目前被认为是一条存在于细胞中的关键信号传导路径，参与调节细胞的多种生物学效应，其在肿瘤的发生发展中发挥着关键调控作用，黄芪活性成分可通过调控PI3K/Akt信号通路起到抗肿瘤的作用[57]。郅强等[58]通过PI3K/Akt/ mTOR信号通路探讨黄芪多糖对结直肠癌自噬的影响，结果发现黄芪多糖可上调自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3BII/I，下调p62蛋白的表达，同时下调p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR11的表达，从而诱导结直肠癌肿瘤和细胞自噬。毛蕊异黄酮可呈剂量相关性抑制HCT116和HT29细胞的增殖并诱导其凋亡，其机制可能是通过雌激素受体β介导的EGFR-PI3K-Akt/EGFR-丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）细胞凋亡途径抑制增殖并诱导其凋亡，且进一步发现毛蕊异黄酮以剂量相关方式抑制EGFR-PI3K-Akt/ EGFR-MAPKs信号通路中EGFR、Bcl-2、p-Akt表达，促进Bax、Caspase-3、cleaved-Caspase-3等凋亡相关蛋白表达[59]。芒柄花素可能通过miR-149诱导星形胶质细胞EphB3下调，抑制PI3K/Akt和STAT3信号通路，进而抑制结肠癌细胞增殖和侵袭[60]。综上，黄芪多糖、毛蕊异黄酮、芒柄花素均可通过PI3K/Akt信号通路对结肠癌的发生发展起抑制作用。见图6。
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3.2调控NF-κB信号通路
NF-κB是存在于细胞中重要的诱导性转录因子，在结肠癌的发生发展中具有重要作用。Yang等[61]研究发现黄芪甲苷通过显著下调NF-κB信号通路关键蛋白的表达，抑制炎症因子TNF-α刺激的NF-κB p65的转录活性，从而抑制结肠癌细胞的体外生长。黄芪甲苷通过调控Bax、Bcl-2、p53、Caspase-3、-6～-9蛋白表达诱导HCT116细胞凋亡，通过调控cyclin D1、cyclin E、p21、p27、CDK2、CDK4蛋白表达诱导细胞周期阻滞，显著抑制HCT116细胞增殖和扩散，并通过NF-κB通路在体内外抑制结肠癌细胞的增殖和生长。Dong等[62]发现在脂多糖诱导的猪肠上皮IPEC-J2细胞中，黄芪多糖可通过抑制MAPK和NF-κB通路，从而抑制炎症因子和趋化因子的产生，显著减少坏死性细胞凋亡，具有免疫调节功能。综上，黄芪甲苷及黄芪多糖可通过调控NF-κB信号通路达到防治结肠癌的作用。
3.3 调控其他信号通路
信号通路在癌症的发生发展中具有至关重要的作用[63]，研究发现，黄芪活性成分可通过调控相关信号通路，从而调控结肠癌细胞的各种生命活动[64]。付远虹等[65]通过Western blotting检测经黄芪多糖处理后，total-PARP、cleaved-PARP、cleaved-Caspase-3、膜联蛋白A3（annexinA3，ANXA3）表达及p38和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）磷酸化表达水平，结果发现黄芪多糖通过降低ANXA3/p38和JNK信号通路从而抑制人结肠癌细胞增殖。Liang等[66]通过研究黄芪甲苷对氧化偶氮甲烷/DSS诱导的结肠炎相关肿瘤的作用，发现黄芪甲苷通过配体结合的方式激活肠上皮细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ信号通路，减轻肠道炎症引起的DNA损伤，从而抑制结肠肿瘤的发生。Auyeung等[67]研究发现黄芪总皂苷通过激活外部凋亡级联及促进相位特异性细胞周期阻滞诱导HT-29细胞的生长抑制，同时受到mTOR信号通路和细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路的调控。综上，黄芪多糖、黄芪甲苷及黄芪总皂苷可通过调控ANXA3/p38、JNK、mTOR和ERK等信号通路进而调控结肠癌细胞增殖、凋亡等生物学过程。
4结语与展望
中医学中强调“正气”在积聚发病过程中的作用，正气的盛衰往往对癌症的发展和预后起着关键作用，故“补气健脾”法可以贯穿肿瘤治疗过程的始终。刘嘉湘教授认为益气健脾可以培补中焦，使气血生化有源，从而使机体“正气存内、邪不可干”，达到扶正治癌的效果[68]。黄芪作为临床上常用的补气药的代表，其活性成分在结肠癌的研究方面表现出确切的疗效和潜在的应用前景。通过总结大量研究文献发现，黄芪作为补中益气的常用药材，其活性成分多糖类、皂苷类、黄酮类化合物可以有效抑制结肠癌的发展发生，主要通过抑制结肠癌早期炎症反应，抑制结肠癌细胞增殖、诱导结肠癌细胞凋亡、抑制结肠癌细胞的侵袭与迁移、增强机体免疫功能及调节相关的信号通路来实现抗结肠癌作用，此外，还能通过防治内质网应激性肠细胞损伤和逆转结肠癌细胞耐药性等发挥作用。通过总结文献发现，黄芪活性成分对细胞增殖与凋亡的影响并非单一的，通常在影响细胞增殖的同时，还会抑制侵袭与转移及促进细胞凋亡。因此大多数体外细胞实验都是通过验证多种机制来证明抗结肠癌的效果。在调节信号通路发挥抗结肠癌作用时，并非仅仅通过一条信号通路起抑制结肠癌作用，有时通过调控众多信号通路起到治疗作用。
黄芪抗结肠癌主要活性成分为多糖、皂苷和黄酮类等物质，然黄芪组成成分复杂，尚有未被发现的成分，且多糖类、皂苷类和黄酮类等亦包含多种成分，分离纯化较为复杂，还需要进一步的分离纯化研究及抗结肠癌活性研究。随着黄芪抗结肠癌的分子机制不断被揭示，中药的多靶点、多环节和多层次的起效机制特点也逐渐显现。但是在黄芪活性成分抗结肠癌研究中，除了分子机制研究外，针对其基因标志物的相关研究仍然需要深入开展，这对疗效及靶向制剂的研发工作具有重要的意义。目前，黄芪活性成分治疗结肠癌的研究仅限于体外细胞实验及体内动物实验，体内外结合实验及临床相关研究较少。后续研究中可进一步通过体内外结合实验及临床试验研究为黄芪治疗结肠癌提供证据支撑，相信对黄芪活性成分作用机制及新靶点的深入研究，将为黄芪在结肠癌治疗领域的研究带来新的突破，结肠癌患者将会获得更大的生存受益。

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