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梅花花色与黄酮类成分相关性及ISSR种质资源遗传多样性分析

城头变幻大王骑

2024/09/13

中药/天然药检测

梅Prunus mume (Sieb.) Sieb. et Zucc.蔷薇科植物，俗名为青梅，原产于我国南方，有着3千多年的栽培史[1]，其既有观赏价值又有药用价值。中药材“乌梅”和“梅花”分别为梅的近成熟果实和干燥花蕾[2]。《神农本草经》最早记载梅的药用价值，果部药物——中品“梅实”：“味酸，平，无毒。主下气，除热烦满，安心…”[3]。据《齐名要术》记载，不同的加工工艺可将梅子制成白梅和乌梅[4]。乌梅作为药食同源的中药材[5]，乌梅果脯、饮品、中药饮片等畅销国内外市场[6]。梅花Mume Flos别名白梅花[7]，具有疏肝中和与化痰散结的效用[2]。
梅花具有丰富的药理作用，其提取物prunose I和prunose II具有抑制血小板凝聚的作用[8]，prunose III则具有清除氧自由基的作用[9]。此外，梅花还有改善便秘[10]，对高尿酸血症及肾病有一定防治效果[11]。梅花的药理作用主要源自其黄酮类化合物[8,11-12]，其黄酮类化合物主要包括苯甲酸、异鼠李素、槲皮素、山柰酚、异槲皮苷、金丝桃苷和芦丁[13]。植物的花色表现的化学基础是花色素，花色素包括了类黄酮、类胡萝卜素和生物碱[14]。黄酮作为类黄酮成分的一个类别，表现为无色或黄色，且其酸性越强黄色越浅[14]。梅花花色属于黄酮类化合物[15]，通常采用高效液相色谱法（HPLC）测定样品的黄酮含量，但其检测成本较高且流程较为复杂。植物的花色可使用红绿蓝（red green blue，RGB）值进行快速评估[16-17]；例如，通过RGB值量化油菜花色差异辅助育种[18]，非洲菊的花色RGB值与其黄酮含量可能存在联系[19]。虽然对乌梅药材的研究较多，但对梅花的研究相对匮乏，少有基于花色RGB值评估其黄酮含量的报告。

种质资源及遗传多样性的调查评估有助于梅资源的保护，通常利用分子标记法从DNA层面阐释植物的遗传变异。简单重复序列间扩增多态（ISSR）适用于评估基因组信息匮乏的物种[20]。四川省达州市达川区作为“中国乌梅之乡”，其乌梅基原纯正，获“国家地理产品标志保护”认证，是乌梅GAP标准制标品种[21-22]。达川区现有梅种植面积6 700 hm2，其中1 500余株树龄达百年以上，2株树龄超过600年（“乌梅帝”和“乌梅后”）[21, 23]。梅产业具有巨大的发展潜力及研究意义，但目前国内对梅种质资源的整体研究与利用不足。本研究期望通过调查梅花花色及其黄酮含量测定探究其内在联系，同时通过ISSR方法评估梅种质资源遗传多样性，为利用和保护梅资源提供参考。
1 材料与仪器
1.1 材料
2022年1月在达州市乌梅山省级现代农业（中药材）园区的核心区取样调查梅花色，样品信息如表1所示，经西南科技大学生命科学与工程学院侯大斌教授鉴为梅P. mume (Sieb.) Sieb. et Zucc.。梅资源保护核心区（乌梅山村3组与4组）的梅种质资源主要源自2株树龄600余年的梅古树—“乌梅帝”与“乌梅后”[21]，2株乌梅古树相距3 km左右。故根据梅种质资源分布特征，调查分别对3个区域布局采样点，包括资源圃（A）区、“乌梅帝”（B）区、“乌梅后”（C）区。“乌梅帝”区域：“乌梅帝”（S29）树龄600年左右，高20 m左右，胸径1.5 m。“乌梅后”区域：“乌梅后”（S41）树龄600年左右，高18 m左右。资源圃区域内乌梅多为村民栽种，位于“乌梅帝”与“乌梅后”之间，植株高5～10 m。梅花调查时，分别对区域内胸径最大的植株取样，同时以其中心半径100 m向外辐射，对胸径20～50 cm植株随机取样。梅花取样时，每株采集枝条中部花瓣全展开但未凋谢的花20朵，装入做好标记的塑封袋，立即放入冰盒中，带回实验室测定相关指标。梅花朵生物学特征见图1。
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对照品芦丁（B20771）、金丝桃苷（B20631）、异槲皮苷（B21529）、槲皮素（B20527）、山柰酚（B21126）、异鼠李素（B21554）购于上海源叶生物科技有限公司，质量分数均大于98%；使用试剂中甲醇和乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。
1.2 仪器

1260安捷伦液相色谱仪（安捷伦有限公司）；V-T3型分光光度计（上海屹谱公司）。
2方法
2.1 梅花色调查
通过RGB扫描法和化学法调查梅花色，对盛开的花（图1-c和1-g），使用扫描仪拍照。参照田露申[18]的方法，随机提取3次花瓣（图1-f）的RBG值并求均值作为花色数据。基于花色RGB数据计算了红绿差值（R_G）、红蓝差值（R_B）、绿蓝差值（G_B），公式（1）～（3）中，R、G、B分别为红、绿、蓝值。
R_G＝R－G （1）
R_B＝R－B （2）
G_B＝G－B （3）
同时，基于RGB值计算了花瓣的绿度指数（greenness index，GI）[24]，具体计算公式如下。
pre_GIa＝(255×3－|G－100|－R－B)/255×3 （4）
pre_GIb＝(255×3－|G－165|－|R－37.5|－
|B37.5|)/25×3 （5）
pre_GIc＝pre_GIb/(1－pre_GIb) （6）
GI＝pre_GIc/12 （7）

红度指数（redness index，RI）[25]、亮度指数（brightness index，BI）[26]、归一化的红度指数（normalized redness index，NRI）[27]，具体公式如下。
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类似于归一化红度指数，计算了归一化的绿度指数（normalized greenness index，NGI）和归一化的蓝度指数（normalized blueness index，NBI），计算公式如下：
NGI＝G/(R＋G＋B) （11）
NBI＝B/(R＋G＋B) （12）
化学法测定流程参考田露申[18]的方法：取鲜样0.10 g，放入离心管中，加入10 mL无水乙醇浸泡4 h；然后5 000 r/min室温离心5 min取上清液待用。每个调查区域选用2份典型花色的花瓣（共计6份），使用分光光度计，在波长400～500 nm内进行扫描获取吸光度（A）值，确定化学法色素的吸收高峰为410 nm（图2）。
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2.2 梅花中黄酮成分的测定[28]
2.2.1 色谱条件 ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），色谱条件：流动相乙腈（A）-水（含0.2%乙酸，B），梯度洗脱（0～10 min，12%～17% A；10～15 min，17%A；15～20 min，17%～17.5% A；20～25 min，17.5%～18% A；25～30 min，18%～30% A；30～40 min，30%～40% A；40～45 min，40%～45% A；45～47 min，45%～12% A；47～50 min，12% A）；检测波长370 nm；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL /min；进样量20 μL；混合对照品溶液和供试品溶液的色谱图如图3所示。
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2.2.2 混合对照品溶液的制备以60%乙醇为溶剂，将芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素分别制成质量浓度分别为1.2、0.21、0.6、0.21、0.198、0.168 mg/mL的对照品溶液，各取适量于20 mL棕色量瓶中，加入60%乙醇至刻度线，将样品摇匀，即得混合对照品溶液。
2.2.3供试品溶液的制备精确称取梅花样品粉末（过3号筛）1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加入50 mL 60%乙醇，密封后超声（40 kHz）提取40 min，室温冷却后滤过，滤液过微孔滤膜得到供试品溶液。
2.2.4线性方程的绘制分别取混合标品溶液1、2、4、6、8、10 mL，以60%乙醇定容至10 mL并摇匀。以横坐标（X）表示对照品的质量浓度、纵坐标（Y）表示峰面积进行线性回归。线性回归结果如表2所示。
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2.2.5 方法学考察在“2.2.1”项液相色谱条件下连续进样测定，本实验精密度的RSD为1.9%～2.3%，稳定性的RSD为1.9%～2.4%，重复性的RSD为2.1%～2.3%；平均加样回收率和RSD分别为芦丁（98.50%和0.33%）、金丝桃苷（99.70%和0.66%）、异槲皮苷（99.97%和0.30%）、槲皮素（99.48%和1.07%）、山柰酚（99.74%和1.21%）、异鼠李素（95.12%和2.55%）。表明仪器精密度良好，供试品在24 h内的稳定性良好，测定方法重复性良好。
2.3 ISSR分子标记
2.3.1 梅基因组DNA提取及检测取正常梅嫩叶，参照CTAB法提取乌梅DNA，以双蒸水（ddH2O）标零，通过微量分光光度计测定DNA溶液在260 nm和280 nm的A值，检测DNA的浓度及纯度，最后通过琼脂糖凝胶电泳确定DNA的提取品质。
2.3.2 ISSR引物筛选及检测参照哥伦比亚大学公布的UBC801～900序列，随机合成19条引物以供筛选，从制备的49份梅DNA中随机抽选1份，进行引物初筛。初选引物经15份梅DNA样品复筛，选出具有清晰扩增条带和多态性丰富的引物9条（表3）。复筛引物经过浓度梯度（0.16、0.24、0.32、0.40、0.50 μmol/L）筛选，确定各自适宜浓度，最后将所有样品进行PCR扩增。PCR反应体系（20 μL）包括Mix酶（10 μL）、引物（1 μL）、DNA模板（1 μL）、ddH2O（8 μL）；扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，退火30 s（47～53 ℃不同引物的退火温度不同），72 ℃延伸15 s，循环32次；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。
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2.4 统计分析
梅花色和黄酮含量数据经Excel整理，R语言（v. 4.3.2）的factoextra包[29]进行主成分分析（principal component analysis，PCA）及非加权组平均法聚类分析（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）的可视化，corrplot包[30]进行相关性分析，vegan包[31]进行主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）。ISSR分子标记数据采用人工核验记录，按照条带有（1）、无（0）记录数据，统计引物扩增总条带数、多态性条带数及多态位点的百分率（percentage of polymorphic loci，PPB），利用popgene32软件评估等位基因数（number of alleles，Na）、有效等位基因数（number of effective alleles，Ne）、Nei’s基因多样性指数（Nei’s diversity index，H）、Shannon’s多态性信息指数（Shannon's index，I）和遗传距离。ISSR数据使用vegan包的vegdist函数，设置jaccard方法转化，使用UPGMA聚类分析。
3 结果与分析
3.1 梅花色及其黄酮含量特征
3.1.1 梅花色特征梅花RGB花色结果表明，资源圃区域花色RGB均值（R：176.3，G：176.3，B：175.4）最高，“乌梅后”区域花色均值（R：174.1，G：175.3，B：174.0）次之，“乌梅帝”区域花色均值（R：170.3，G：170.8，B：170.1）最低（表4）。
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R_B在资源圃区最小，“乌梅帝”区次之，“乌梅后”区最大，而R_G则与红蓝色差值规律相反（表4）。R_G在“乌梅后”区最大，资源圃区次之，“乌梅帝”区最小。基于梅花RGB计算的花色GI、RI、NRI、NGI、NBI指数变化幅度较小；RGB色值和亮度指数表明“乌梅帝”花色最暗、“乌梅后”花色次之、种质资源圃花色最亮。花瓣色素A值在“乌梅后”区最高，资源圃次之，“乌梅帝”区最低。
3.1.2 梅花黄酮含量特征梅花黄酮含量结果表明，所有样品均检出槲皮素（表5）。除资源圃的3号样本外其余样品均检出芦丁和异槲皮苷，7个样本未检出金丝桃苷，10个样本未检出山柰酚，30个样品未检出异鼠李素。检测的6种黄酮含量存在较大的变异，3个调查区域的芦丁、金丝桃苷、异槲皮素、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的变异系数分别为39.58%～56.61%、60.07%～96.68%、54.77%～62.83%、61.43%～77.20%、41.12%～79.93%和25.64%～42.27%。资源圃、“乌梅帝”和“乌梅后”区样本的芦丁含量检出量为0～11.142 mg/g，资源圃样本金丝桃苷（1.008）、异槲皮素（2.572）、槲皮素（0.364）检出均值最高，“乌梅帝”和“乌梅后”区的金丝桃苷（0.606和0.686）检出均值则相近，而各区域的异鼠李素检出均值在0.039～0.049 mg/g。此外，“乌梅帝”植株和“乌梅后”植株梅花均含有6种黄酮，部分“乌梅帝”和“乌梅后”区域梅花则发现金丝桃苷、山柰酚及异鼠李素未检测出的梅花。资源圃则发现芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、山柰酚、异鼠李素未检测出的梅花。各调查区域间的梅花黄酮含量差异暗示乌梅植株种内变异大及种质资源的丰富度高。
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3.1.3 梅花色与黄酮含量的关系主成分分析结果表明，资源圃、“乌梅帝”和“乌梅后”区域的95%置信区间相互重叠，即3个调查区域并不相互独立（图4）。梅花色参数、黄酮含量及样本对各主轴贡献如图4所示。主轴1（PC1）方差解释率为43.4%，解释花色的变化，如RGB值与花色红度与绿度。主轴2（PC2）方差解释率为15.7%，解释梅花黄酮含量变化；主轴3（PC3）方差解释率为13.6%，解释乌梅黄酮含量、归一化蓝度指数和蓝绿色差（图5-A）。
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聚类分析将样本分为3类（图5-C）：第1类只有S17号，其6种黄酮含量之和最高（19.676 mg/g）；第2类包含S2、S3、S4、S9、S23、S24、S25、S26、S29、S39、S40、S41、S50、S51、S52号，群体RGB均值较高（R：182.2，G：181.1，B：179.9），且色差为正，金丝桃苷质量分数均值较高（4.98 mg/g）和芦丁含量均值较低（0.93 mg/g）；剩余第为3类，花色RGB均值较低（R值：171.5，G值：172.4，B值：171.6），金丝桃苷均值较高（5.70 mg/g）和芦丁均值较低（0.59 mg/g）。样本对主轴贡献度结果表明，对PC1贡献较高样品，如S2、S4、S6、S46等总黄酮含量较高（12.9、11.9、11.9、11.5），S12、S23、S24、S32、S33则总黄酮含量较低（图5-B）。PC2主要解释黄酮变化，S17号样品总黄酮含量最高且对PC2贡献高。
相关性分析结果表明，梅花的花色参数与梅花的黄酮含量无显著相关关系（图6）。梅花的异槲皮素与芦丁和金丝桃苷含量呈显著正相关，异槲皮素与槲皮素呈显著正相关。槲皮素与山柰酚和异鼠李素呈显著正相关，山柰酚与异鼠李素呈显著正相关。
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3.2 ISSR扩增结果及遗传多样性分析
3.2.1 ISSR引物筛选及扩增本实验参照UBC801～900序列随机合成的19条引物，经初筛和复筛后确定了9条适宜引物。选出的9条引物经PCR扩增总计得到59条条带，平均扩增6.55条条带；多态性条带共计58条，平均6.44条多态性条带，多态位点百分率（PPB）为98.3%。除N23引物的PPB为75%外，其余引物均为100%（表6）。
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3.2.2 ISSR种质遗传多样性分析 ISSR种质遗传多样性分析结果表明（表7），49个样品在群体水平上有较多的Na（1.983 1）、Ne（1.481 0）、H（0.293 0）和I（0.449 4）。“乌梅帝”区域的Ne（1.423 9）和H（0.260 6）最低，资源圃区的Ne（1.479 2）、H（0.292 5）和PPB（94.92%）最高。3个调查区域的遗传距离为0.006 5～0.017 0，资源圃和“乌梅后”区域的遗传距离最小（0.006 5），说明其亲缘关系较近。
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此外，资源圃和“乌梅后”区域的遗传一致性最高（0.993 5），“乌梅帝”区与资源圃区（0.988 5）及“乌梅后”区（0.983 2）的一致性则较低。此外，基于ISSR的PCoA结果表明，3个调查区域内的种质资源混杂（图7）；尤其“乌梅帝”区域的种质变异程度高，资源圃区和“乌梅后”区存在较高的同质性。49份乌梅种质资源的ISSR标记聚类分析结果表明，若将其分为3类：第1类包括S1、S10、S30、S32、S40样品，第2类仅包括样品S47，剩余样品为第3类。结合种质资源调查的表1，推测资源圃中的S1和S10植株可能源于“乌梅帝”区，“乌梅帝”和“乌梅后”区的植株均存在混杂，两区域间可能存在相互移栽的情况，致使难以分开。聚类分析则证实资源圃的S1和S10样品与“乌梅帝”区域的样品可聚为一类；且“乌梅帝”和“乌梅后”区样品存在聚为一类的情况（图8）。“乌梅后”（S41）与“乌梅帝”（S29）属于同一进化分枝，同时分枝内还包含了资源圃及“乌梅帝”和“乌梅后”区域内的其他植株（图8）。这进一步表明“乌梅帝”与“乌梅后”植株的亲缘关系，及3个调查区域内植株的亲缘关系。
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4 讨论
本研究通过RGB色值和色素吸光度法量化研究了梅花花色特征。梅花RGB色值和亮度指数表明3个调查区域存在差异，“乌梅帝”花色最暗、“乌梅后”花色次之、种质资源圃花色最亮。同时，梅花黄酮含量结果表明，“乌梅帝”和“乌梅后”植株的花均含有6种黄酮，而相应区域内的部分梅花未检出金丝桃苷、山柰酚及异鼠李素。这表明乌梅保护区内的梅植株存在较大的种内变异及较高的种质资源的丰富度。尽管调查区域间的梅花有着各自的RGB、A值和黄酮含量特征，PCA分析、相关分析和聚类分析结果表明，以花色RGB值和色素吸光度预测梅花黄酮含量不可行。此外，本课题组还尝试了基于梅花特征的随机森林模型预测梅花黄酮含量，但不能准确预测。前人研究表明，通过RGB色值评估不同成熟度桑葚[32]的类黄酮、总酚、糖含量和柴胡的挥发性油、柴胡皂苷是可行的，这可能与研究对象的成熟度不同相关。本研究中，调查的梅花不存在生长阶段的差异，同时花色均为淡白色，使得RGB变化幅度小。黄酮类物质表现为无色或黄色，且其酸性越强黄色越浅[14]，故可以考虑将花色与pH结合[33]，探究种质资源间黄酮与pH的关系，以建立简单快速的黄酮含量鉴定体系。
此外，PCA、相关性分析及聚类分析结果暗示了梅花黄酮含量间存在联系，但由于个体间变异大使得相关性大多不显著。基于花色特征和黄酮含量的进化树聚类分析表明，“乌梅帝”（S29）和“乌梅后”（S41）聚为一类。同时，“乌梅帝”“乌梅后”及资源圃的其他个体植株存在聚为一类的结果，表明梅资源的变异性较大。植物存在天然变异情况，同时由于异花授粉，可能潜在的造成梅资源的多样性。故本研究进一步通过ISSR分子标记，探究了其基因多样性。
本研究筛选到9条ISSR引物并扩增59条条带，包含58条多态性条带，PPB为98.3%。资源圃有较高的H和I值，而“乌梅帝”最低，这也佐证了“乌梅帝”区与“乌梅后”和资源圃区的亲缘特征。此外PCoA结果表明3个调查区域间存在大量重叠，表明各区域内的种质资源混杂，导致丰富的遗传多样性。物种的遗传多样性受环境因子及人为活动的影响，如自然选择、人工选育及种苗移栽。为保护乌梅的种质资源及产业的长远发展，有必要保护生境，开展种质资源的原生境保护和非原生境保护工作。

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