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【金秋计划】地黄苷靶向结合并抑制RPL27A泛素化降解改善造血功能

城头变幻大王骑

2024/09/10

中药/天然药检测

传统化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）一直是临床上最常用的化疗药物之一。由于其细胞杀伤特异性较低，给药后常出现明显的不良反应，其中骨髓毒性最为显著。前期研究表明，中草药来源的天然化合物地黄苷（Martynoside，MAR）具有造血活性，可在体内外减轻5-FU对的细胞毒性，且不会干扰5-FU体内抗肿瘤活性。然而，MAR的直接分子靶点尚未见报道，MAR的作用机制也知之甚少。2023年8月15日，西湖大学孙仁教授及浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所杜雨棽研究员团队在Science Bulletin（IF=18.8）发表题为“Martynoside rescues 5-fluorouracil-impaired ribosome biogenesis by stabilizing RPL27A”的文章，确定了RPL27A是MAR的功能性细胞靶标。机制上，MAR通过直接结合RPL27A，增加其蛋白稳定性来减弱5-FU诱导的RPL27A蛋白水平降低，缓解5-FU抑制的核糖体生物合成，从而促造血功能。

1、地黄苷的靶蛋白RPL27A的确定为了鉴定MAR在细胞内的蛋白靶点，研究人员应用了最近开发的md-LED技术（该技术整合人类外显子文库，mRNA展示技术和高通量测序技术）。在排除对照组的非特异结合蛋白后，选择了5个蛋白（RPL27A、POM121L12、CTSG、CARD6和MMAA）进一步Pulldown验证，发现MAR与RPL27A存在互作，并通过ITC实验证实了MAR与RPL27A特异性结合，分子对接以及蛋白点突变后的Pulldown和ITC实验确定了结合能力及关键结合位点，结果表明MAR与RPL27A的R87和K116关键残基直接结合

2、MAR阻断K92和K94的泛素化逆转5-FU诱导的RPL27A蛋白降低之前的研究发现5-FU治疗严重损害造血功能，减少骨髓健康指标BMNCs（骨髓有核细胞）数量，而MAR增加了5-FU处理的小鼠的BMNCs数量。在本研究中，作者进一步检测了5-FU和MAR在体内对BMNCs中RPL27A蛋白和mRNA表达的影响，发现5-FU引起RPL27A蛋白丰度的急剧降低，而MAR的联合给药部分恢复了RPL27A蛋白水平，但不上调其mRNA表达。此外，前期BMNCs的RNA-Seq数据验证了5-FU和MAR处理后RPL27A mRNA表达没有变化。接着，在体外细胞模型中测试MAR的药效之前，作者通过质谱评估了MAR穿透细胞的能力，发现MAR可以穿透细胞，特别是细胞核，与RPL27A互作。5-FU诱导的BMNC损伤的体外模型显示，与体内数据一致，MAR减弱了5-FU引起的RPL27A蛋白丰度的降低，但不上调其mRNA表达（图2）。图2 MAR逆转5-FU诱导的RPL27A蛋白降低，但不影响mRNA表达为了确定MAR逆转5-FU诱导的RPL27A蛋白降低是通过特定相互作用发生的，作者突变了RPL27A，发现MAR部分逆转了5-FU诱导的野生型细胞的蛋白减少，而不能逆转RPL27A突变体细胞（K116Y-RPL27A）。总之，体内和体外的数据都表明RPL27A蛋白水平受5-FU的影响，并且可以通过添加MAR来恢复。有文献报道，核糖体蛋白RPs可以被快速泛素化并通过蛋白酶体降解，接着作者检测了MAR对RPL27A蛋白表达的调控是否通过干扰泛素-蛋白酶体途径来实现。结果显示与5-FU单独处理相比，证实MG-341（26S蛋白酶体复合物抑制剂）挽救了RPL27A蛋白水平。免疫共沉淀实验发现MAR降低了WT-RPL27A的泛素化水平，但对K116Y-RPL27A无影响，结果表明MAR与RPL27A的直接结合阻断了5-FU诱导的游离RPL27A的泛素化和降解。进一步通过质谱发现泛素化修饰位点，揭示K92和K94是RPL27A中的响应泛素化位点，MAR结合可能在空间上阻断RPL27A在K92和K94位点的泛素化，从而阻止5-FU诱导的蛋白质降解

3、MAR上调RPL27A蛋白水平恢复5-FU降低的成熟rRNA丰度在核糖体生物发生步骤中，rRNA加工是关键步骤，也是5-FU诱导细胞毒性的主要干扰靶点，导致成熟的28S、18S和5.8S rRNA生成量降低。作者发现用MAR恢复了RPL27A（核糖体大亚基蛋白）水平，且挽救5-FU降低的成熟rRNA丰度。结果表明RPL27A可能通过促进rRNA加工来促进成熟rRNA的产生，并且该功能可以被MAR调控

4、MAR通过抑制5-FU减少的RPs的泛素化增加RPs的丰度为了检测RPs（核糖体蛋白）和细胞总蛋白丰度的整体变化，作者开展了蛋白质组学和泛素化修饰组学，并与RNA-Seq数据进行了整合。差异表达蛋白网络分析显示MAR对核糖体通路的影响最大。深入分析RP丰度的变化发现，5-FU处理导致小亚基RPs（RPSs）和大亚基RPs（RPLs）的丰度普遍降低，而MAR的加入部分恢复了被5-FU降低的RPs的蛋白水平。此外，敲低RPL27A后，细胞中RPL13A和RPS16蛋白水平降低，表明MAR通过特异性结合RPL27A发挥作用，RPL27A可能在调节核糖体生物合成中发挥关键作用

5、MAR恢复5-FU损伤的核糖体丰度和功能前面结果的发现MAR增加了成熟rRNAs和RPs的整体丰度，表明MAR可能恢复了5-FU处理细胞的核糖体生物发生和蛋白质合成。此外，对差异泛素化蛋白进行功能分类发现，MAR调控的蛋白广泛参与蛋白质翻译，表明MAR可能影响核糖体丰度和功能。接着作者进行核糖体分析实验，发现MAR增加了5-FU处理的细胞中成熟单核体和功能活性多聚核糖体的产生。此外，5-FU减少了新合成蛋白的产生，而MAR的加入和RPL27A的过表达部分逆转了5-FU引起的蛋白合成速率的降低。结果表明在5-FU存在的情况下，MAR可能通过增强RPL27A介导的核糖体生物合成来提高翻译效

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