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益母草碱缓解情志应激导致的帕金森病“易感性”

城头变幻大王骑

2024/09/18

中药/天然药检测

“情志致病”是中医病因学的重要组成部分，指情志不畅会导致疾病的发生。随着现代生活节奏加快，工作压力不断增加，情志应激与疾病的关联越来越受到重视。PD发病主要与遗传内因和环境外因有关，有相同PD基因型的个体在不同的情志状态，对PD的“易感性”不同。
从天麻钩藤饮（中医治疗PD的经典名方）化合物库中筛选出能够抑制ALOX15与PEBP1结合的天然化合物—益母草碱（Leo），并发现Leo能明显缓解情志应激加剧的PD样行为障碍，降低PD易感性。

该研究通过拘束应激模拟“情志失调”诱导肝损伤的发生，发现拘束应激制造成生物节律的失调，其中主要引起生物节律因子BMAL1发生显著动荡，增加其表达水平。随后研究发现，BMAL1可直接与磷脂过氧化调节的重要酶ALOX15的启动子序列结合，促进其表达，致使以氧化磷脂（oxPLs）为代表的大量氧化脂质产物堆积。而肝细胞的大量磷脂过氧化状态，是一种高势能、高熵值的不稳定状态，会导致对病毒、肿瘤等重大疾病易感性增加。此外，片仔癀属于清热类名贵中成药，药理作用广泛，临床上多应用于保肝护肝，该研究在解释情志应激诱导肝脏损伤的作用机制的基础上，表征了片仔癀调节BMAL1-ALOX15通路，降低情志应激小鼠肝脏中的脂质过氧化水平，缓解肝损伤。

1、应激诱导的磷脂过氧化作用增强PD易感性
为了探究生理应激对PD的影响，作者首先从PD模型（hSNCAA53T转基因小鼠）出发，通过拘束应激模拟“情志失调”，发现慢性拘束应激模拟的情志应激状态能显著缩短A53T小鼠的发病时间。此外，在压力后A53T小鼠的中脑脂质过氧化终产物4-HNE和MDA的水平均升高，LC-MS/MS的磷脂组学也显示应激A53T小鼠的中脑存在广泛的磷脂过氧化，其中铁死亡标记物磷脂酰乙醇胺过氧化物（ox-PEs）最为突出，压力还改变了铁死亡途径中涉及的蛋白质和基因，这些结果表明压力可能通过磷脂过氧化增加PD敏感性（图1）。
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图1 应激诱导的磷脂过氧化作用增强PD易感性
2、应激引起的CORT升高有助于磷脂过氧化和PD易感性
与啮齿动物的中枢应激反应系统（由HPA轴控制）通常通过释放皮质类固醇做出适应性反应的理论一致，激素组学分析的结果表明，小鼠受到压力后CORT（皮质酮）是最显著改变的激素。且在A53T小鼠中CORT加剧了行为障碍、多巴胺能神经元损失等表型，且增加4-HNE和MDA以及磷脂过氧化，改变了参与铁死亡相关途径的蛋白质和基因，与压力引起的类似。这些结果表明CORT可能在应激过程中促进磷脂过氧化发挥重要作用，进而导致PD的易感性（图2）。
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图2 应激引起的CORT升高有助于磷脂过氧化和PD易感性
3、CORT诱导的磷脂过氧化是由ALOX15与PEBP1结合介导的
PE结合蛋白1（PEBP1）通常与Raf-1激酶结合并抑制Raf-1激活的MEK/ERK途径，而PKC磷酸化会导致PEBP1从Raf-1解离以及下游蛋白的激活。有证据表明，Raf-1释放的PEBP1与15-脂氧合酶-1（ALOX15）结合并形成复合物，催化含有多不饱和脂肪酸的膜脂的氧化，进而引发铁死亡细胞。作者发现A53T小鼠表现出ALOX15表达的显著上调，这与压力无关。在应激的WT和A53T小鼠中观察到PEBP1磷酸化显著增加，表明PEBP1可能与Raf-1解离。考虑到在接受应激或CORT处理的小鼠中脑中观察到磷脂过氧化物的显著积累，作者研究了ALOX15/PEBP1复合物的变化，发现CORT 显著增强了PEBP1和ALOX15之间的相互作用，而Raf-1/PEBP1复合物解离，且应激诱导显示出和CORT 类似效果。这些发现表明A53T诱导的ALOX15上调和CORT诱导的PEBP1解离可能是随后脂质过氧化的原因（图3）。
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图3 CORT诱导的磷脂过氧化是由ALOX15与PEBP1结合介导的
4、ALOX15对于应激诱发的PD易感性至关重要
有研究报道铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）能够通过自由基捕获和干扰ALOX15/PEBP1形成来抑制磷脂过氧化。作者发现Fer-1逆转了A53T小鼠应激诱导的PD易感性，减弱了应激诱导的脂质过氧化和铁死亡信号通路激活，降低了应激诱导的ALOX15/PEBP1复合物的水平，表明多巴胺能神经元的铁死亡变性可能在PD易感性增强中发挥着至关重要的作用。由于ALOX15对于膜中的脂质过氧化至关重要，作者采用Alox15敲除小鼠发现ALOX15敲除显著减弱了与 A53T 和压力相关的PD运动和协调功能受损，且对多巴胺能神经元的损伤显著减少，中脑中因过度表达的A53T和应激而出现的脂质过氧化水平较低，表明ALOX15/PEBP1在PD小鼠模型中应激增强的易感性中发挥着至关重要的作用（图4）。
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图4 ALOX15对于应激诱发的PD易感性至关重要
5、益母草碱抑制ALOX15与PEBP1结合从而抑制铁死亡
作者之前发现天麻钩藤颗粒（TG）的中药制剂通过抑制ALOX15介导的脂质过氧化来减轻PD模型的行为障碍，为了发现潜在的活性化合物，作者将TG的主要成分与ALOX15对接，发现在所研究的17种化合物中益母草碱通过与靠近PEBP1结合位点的Arg166、Glu169、Lys172和Phe167 形成氢键，表现出与ALOX15 互作的最大潜力。此外，通过MST、CETSA也证明益母草碱直接结合ALOX15而不是PEBP1。但是，益母草碱不会抑制ALOX15酶活性，而是破坏ALOX15/PEBP1相互作用，因此，即使在ALOX15过表达时，益母草碱剂量依赖性地挽救了RSL3诱导的铁死亡和脂质过氧化。此外，益母草碱显著逆转CORT诱导脂质过氧化产物4-HNE和MDA增加，以及TFRC和Ptgs2激活，这些结果表明益母草碱抑制ALOX15与PEBP1结合从而抑制铁死亡（图5）。
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图5 益母草碱抑制ALOX15与PEBP1结合从而抑制铁死亡
6、益母草碱减轻应激小鼠对PD的易感性
最后，作者采用MPTP诱导的PD小鼠模型和先前描述的PD易感小鼠模型评价益母草碱的疗效，发现益母草碱治疗能显著改善小鼠运动协调性，逆转多巴胺能神经元损失和与PD相关的脂质过氧化。进一步研究了益母草碱对小鼠体内ALOX15和PEBP1结合的影响，发现益母草碱显著降低了ALOX15和PEBP1的结合，同时倾向于增加PEBP1与Raf-1的结合。此外，益母草碱显著减少A53T和应激引起的膜脂过氧化物的积累，降低TFRC和Ptgs2的水平。研究结果表明益母草碱可能通过抑制脂质过氧化来降低小鼠对PD的易感性（图6）。
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图6 益母草碱减轻应激小鼠对PD的易感性
总结
拘束应激激活HPA轴释放皮质激素，其中，皮质酮（CORT）变化最为显著。随后，CORT激活蛋白激酶PKC通路，促使PE结合蛋白PEBP1发生磷酸化从而从Raf-1上解离，游离的PEBP1与脂氧合酶ALOX15形成强有力的过氧化磷脂的催化器，致使以oxPEs为代表的大量的氧化脂质产物的堆积，增加DA神经元对铁死亡（ferroptosis）的易感性，并最终造成PD的发生和发展。因此，ALXO15-PEBP1可能作为PD治疗药物开发的潜在靶点，中药复方天麻钩藤饮中的活性成分益母草碱能有效抑制ALXO15-PEBP1结合，延缓神经元的脂质氧化和退行性丢失（图 7）。

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