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【金秋计划】基于性状电子检测技术结合机器学习的不同产地薏苡仁的快速鉴别

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2024/09/10

中药/天然药检测

薏苡仁为禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L. var. ma-yuen (Roman.) Stapf的干燥成熟种仁。秋季果实成熟时采割植株，晒干，打下果实，再晒干，除去外壳、黄褐色种皮和杂质，收集种仁^[1]。薏苡仁性寒，入肺胃及脾经，有利脾健胃、渗湿利尿、清热排脓等功效，可用于治疗脾虚泄泻、小便不畅、痈疽不溃以及水肿等病症^[2]。薏苡仁中的主要活性成分包括脂肪酸类、多糖类^[3]、黄酮类、三萜类、甾醇类等^[4]，其中脂肪酸类的主要成分是甘油三油酸酯，除此之外还含有薏苡素、生育酚、角鲨烯等多种活性成分。现代研究表明，薏苡仁具有调节血脂、降低血糖、抗肿瘤、抗炎、提高机体免疫力等药理作用^[5-7]。我国是薏苡仁种植大国，栽培历史十分悠久，目前全国的薏苡仁种植面积已经超过了一百万亩（66 667 公顷）。除甘肃、宁夏等少数省份外，在其他各省份均有分布，其中以贵州、福建和云南等省为主产地^[8]。相关研究表明，地理位置、气候、温湿度等外部环境因素的不同导致了各地薏苡仁中甘油三油酸酯和薏苡素等有效成分的含量差异较大。薏苡仁药材品质的差异对其临床疗效有很大的影响，因此需要对不同产地的薏苡仁进行综合分析考察，以保证薏苡仁的质量和临床功效^[9-12]。

近年来，性状电子检测技术用于中药的全面分析和质量控制已成为一种趋势，其中以分光测色技术和超快速气相电子鼻技术尤为典型。分光测色技术通过将检测样品的光谱数据转换为颜色参数（L^*、a^*、b^*），实现颜色的客观量化，建立L^*a^*b^*模型。该模型是一种三维空间的色彩模型，L^*、a^*、b^*分别代表颜色的亮度、红绿色方向、黄蓝色方向。该技术操作简便，只需将样品打粉过筛，无需进行其他处理和使用化学试剂。超快速气相电子鼻是一种基于顶空气相基本原理的新型气味分析仪器，拥有氢离子火焰检测器和2根极性不同的色谱柱，分别为MTX-5（弱极性）和MTX-1701（中极性），能够全面客观地识别中药整体气味信息，实现气味的量化。该仪器分析时间短，检测效率高，仅需2～3 min即可完成样品的检测。作为新兴智能性状电子检测技术，分光测色技术和超快速气相电子鼻技术都具有快速、准确、便捷的特点，能够准确地将传统的鉴别经验转化为客观数据，目前已应用在中药的产地鉴别、真伪鉴别、炮制品鉴别等多个领域^[13-19]。

因此，本实验采用电子眼联合气相电子鼻技术，对不同产地薏苡仁的进行快速鉴别，并成功筛选出不同产地薏苡仁的气味标志物。同时对薏苡仁的表面颜色与内在气味成分进行相关性分析，探索颜色与成分之间的相关性，为薏苡仁的“辨状论质”提供客观依据。
1 材料与试剂1.1 材料26批薏苡仁药材分别收集于云南（Y1～Y5）、江苏（J1～J6）、福建（F1～F4）、山东（S1～S4）和贵州省（G1～G7），具体来源信息见表1。所有样品经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，均为禾本科植物薏苡C. lacryma-jobi L. var. ma-yuen (Roman.) Stapf的干燥成熟种仁。分析前，样品均储存在室温、干燥、密封的条件下。CM-5分光光度计（日本柯尼卡美能达公司）；Heracles NEO超快速气相色谱电子鼻（法国Alpha MOS公司）。1.2 试剂正构烷烃nC₆～nC₁₆混合对照品（批号A0142930），购自美国RESTEK有限公司。
2 方法2.1 颜色测定使用CM-5分光光度计，样本观察脉冲下氙弧灯（D65，ф3mm）的视角设置10°，校准后，选择SCE模式。将薏苡仁样品粉碎（过3号筛），放入检测皿中，每个样品重复测定2次，以平均值为最终测定结果。2.2 超快速气相电子鼻分析2.2.1 样品孵化将薏苡仁样品粉末（3 g）放入20 mL顶空瓶中，机械臂将顶空瓶送至孵化箱中，在80 ℃条件下孵化20 min，孵化炉转速为500 r/min，部分气味挥发并聚集在小瓶顶部，最终达到平衡的状态。2.2.2 电子鼻分析方法使用Heracles NEO超快速气相色谱电子鼻对薏苡仁样品进行检测分析。该仪器由自动采样装置、包含2根不同极性色谱柱的检测系统、2个氢火焰离子化检测器组成。进样体积为5 000 μL，进样口的温度为200 ℃，压力为10 kPa，体积流量为125 μL/s。捕集阱初始温度为40 ℃，并以1.0 mL/min的速度持续50 s。程序升温方式：初始温度为50 ℃，先以1 ℃/s升至80 ℃，然后以3 ℃/s升至250 ℃，保持21 s，总采集时间为110 s。氢火焰离子化检测器温度为260 ℃，使用体积流量为1.0 mL/min的氮气作为载气。每个样品重复测定2次。2.2.3 气味成分的鉴定采用正构烷烃标准溶液（nC₆～nC₁₆）进行校准，将保留时间转化为保留指数，然后通过Kovats保留指数定性，在Arochembase数据库中对挥发性化合物进行分析鉴定。2.3 数据分析使用Matlab 2021a软件对色度值进行DT和KNN分析，以真正率（true positive rate，TPR）（公式1）和假负率（false negative rate，FNR）（公式2）来评价模型的预测能力，使用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC曲线）评判模型的综合性能。TPR＝TP/(TP＋FN) （1）FNR＝FN/(TP＋FN) （2）TP代表真实类别是正类，预测结果也是正类；FN代表真实类别是正类，预测结果是负类一般来说，TPR的值越高，FNR的值越低，ROC曲线下的面积越大，表明模型的预测能力越好。使用IBM SPSS Statistics 26.0 software（SPSS Inc.，Chicago，IL，美国）建立不同产地薏苡仁的颜色参考范围和Bayes判别模型。使用Simca-p软件（Simca Imola S.C.，Imola，Bologna，意大利）对电子鼻分析结果进行PLS-DA分析；最后采用皮尔逊（pearson）检验对颜色值和挥发性成分进行关联分析。
3 结果与分析3.1 电子眼分析3.1.1 颜色测定方法的验证对颜色测定方法进行验证，连续6次测定同一份样品，颜色值（L^*、a^*、b^*）的相对标准偏差（RSD）均小于1.60%，表明该仪器有良好的精密度。分别在0、2、4、8、12、24 h测定同一份样品，颜色值（L^*、a^*、b^*）的RSD均小于2.90%，表明该样品粉末在24 h内有良好的稳定性。取同一批样品，平行制备6份粉末，分别测定颜色值（L^*、a^*、b^*），6组颜色值的RSD均小于1.00%，表明该方法具有良好的重复性。3.1.2 基于机器学习算法的薏苡仁产地区分机器学习算法（machine learning，ML）在图像处理和大数据分析中是一项至关重要的技术，被广泛运用于医学、药学、经济学、生物学等多个科学领域中^[20-^23]。其中最主要的分类方法是根据训练过程中得到监督的类型进行区分，可将其分为监督学习、非监督学习、半监督学习等^[24]。决策树（decision tree，DT）模型是其中一种被普遍应用的监督学习方法，原理是通过构建分类树或分类规则来对数据进行分类^[25]。谭有珍等^[26]的研究表明，决策树模型可用于区分沉香及其混伪品，该方法快速高效。k最邻近算法（k-nearest neighbor，KNN）模型是一种直观且容易实现的有监督分类算法，其核心思想是通过寻找与待分类的样本在特征空间中距离最近的k个已标记样本，将k个样本中占比最高的类别，标记给待分类样本^[27]。本实验基于薏苡仁外观色泽建立了DT和KNN模型，用来区分不同产地的薏苡仁，结果见图1。使用混淆矩阵图将2种模型的区分结果进行可视化，采用k折交叉验证法（k＝10）进行测试，其中YN、JS、FJ、SD、GZ分别代表云南、江苏、福建、山东、贵州。以DT模型为例，从图1-A中可以看出，云南产地的10个样本有8个被正确划分，贵州产地12个样本有11个被正确划分，福建产地8个样本均被正确划分，山东产地8个样本有7个被正确划分，贵州产地14个样本有12个被正确划分。由图1-B可知，DT模型中各产地预测正确率（TPR）分别为80.0%、91.7%、100%、87.5%、85.7%，均高于80.0%，而FNR均小于20.0%，表明DT具有较强的区分能力。图1-D、E显示，KNN模型中各产地的TPR均高于75.0%，而FNR均小于25.0%，表明KNN同样具备较强的区分能力。从图1-C和F可以得知，2种模型的ROC曲线下面积均大于0.8，表明模型预测能力可靠。

3.1.3 颜色参考范围的建立虽然DT和KNN模型能够较好区分薏苡仁的产地，但是无法客观量化不同产地的颜色差异。因此，在DT与KNN分析的基础上，使用SPSS 26.0软件，以95%为置信水平，选择均值建立不同产地薏苡仁的颜色参考范围，结果见表2。采用单因素方差分析验证所建立的颜色参考范围的合理性，结果见表3。结果显示，不同产地L^*、a^*、b^*的P值均＜0.01，表明5个产地薏苡仁的颜色参考范围具有显著性差异，所建立的颜色参考范围能够进行有效区分。
3.1.4 不同产地薏苡仁快速判别模型的建立在客观量化不同产地薏苡仁的颜色差异后，将薏苡仁样品的色度值录入SPSS 26.0软件，采用判别分析中的典型判别函数-Bayes判别法建立数学判别模型，快速判别薏苡仁的产地来源。判别函数式如下：Y_云南＝12.015 L^*－386.693 a^*＋199.026 b^*－2 776.941Y_江苏＝45.588 L^*－406.540 a^*＋203.829 b^*－2 831.162Y_福建＝46.635 L^*－388.272 a^*＋194.427 b^*－2 838.484Y_山东＝45.578 L^*－410.911 a^*＋206.105 b^*－2 851.388Y_贵州＝45.417 L^*－408.768 a^*＋205.053 b^*－2 828.340将未知样本的颜色值代入上述判别函数计算Y，并以最大Y确定未知样本的处理程度：如果Y_云南最大，则样本为云南产地的薏苡仁；如果Y_江苏最大，则为江苏产地的薏苡仁；如果Y_福建最大，则为福建产地的薏苡仁；如果Y_山东最大，则为山东产地的薏苡仁；如果Y_贵州最大，则为贵州产地的薏苡仁。最后，采用初始和交叉验证的方法评估所建模型的预测能力，结果见表4。在交叉验证实验中，各产地交叉验证的正确率均为100%，表明该模型预测能力较强，可用于快速判别不同产地的薏苡仁。
3.2 超快速气相电子鼻分析
3.2.1 超快速气相电子鼻检测条件的优化为了得到良好的分析效果，通过单因素实验对气相电子鼻主要参数进行了优化：样品用量（1、2、3、4 g）、进样量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μL）、孵化温度（60、65、70、75、80 ℃）、孵化时间（15、20、25、30 min）。结果表明，当样品用量为3 g，进样量为5 000 μL，孵化温度为80 ℃，孵化时间为20 min时，色谱图信息良好。3.2.2 超快速气相电子鼻检测方法的验证连续6次检测同一批次样品，5个特征峰的保留时间RSD均＜0.30%，峰面积RSD均＜4.80%，表明该方法有良好的精密度。取同一批样品，平行制备6份粉末，进样检测，5个特征峰的保留时间RSD均＜0.40%，峰面积RSD均＜4.90%，表明该方法有良好的重复性。分别在0、2、4、8、12、24 h检测同一批次样品，5个特征峰的保留时间RSD均＜0.40%，峰面积RSD均＜5.00%，表明该样品粉末在24 h内有良好的稳定性。3.2.3 判别因子分析与热图分析使用超快速气相电子鼻对不同产地薏苡仁的气味进行分析，结果见图2。综合MTX-5和MTX-1701，从整体气味信息来看，云南、贵州、福建产地的薏苡仁气味强度明显高于江苏和山东产地的薏苡仁。
为了进一步探究不同产地薏苡仁的气味差异，根据电子鼻检测结果，进行判别因子分析，结果见图3-A、图3-B。提取贡献率最大的3个判别因子，贡献率分别为87.034%、9.922%、1.800%，累积贡献率98.756%，这说明DFA模型能充分体现出各个产地薏苡仁样品的气味信息和特征。由图3-A、B可知，各产地薏苡仁样本距离较远，表明不同产地的薏苡仁在气味信息方面存在较明显的差异。
在DFA分析基础上，将不同产地薏苡仁的气味强度差异进行可视化。根据超快速气相电子鼻的分析结果，将每个成分的最大峰面积设置为100%，并对其余色谱峰进行归一化处理，进行热图分析，结果如图3-C所示。根据图3-C可知，不同产地的薏苡仁在气味强度方面存在明显的差异。其中福建产地的薏苡仁气味强度最高，其次为贵州和云南产地的薏苡仁，山东和江苏产地的薏苡仁气味强度较弱，这与气味指纹图谱的分析结果相一致。3.2.4 气味成分鉴定与差异标志物确定通过计算不同产地薏苡仁共有峰的Kovats保留指数，将其与Arochembase数据库进行比较，确定各个产地薏苡仁的挥发性成分，结果见表5。
为了寻找不同产地薏苡仁的气味差异标志物，使用simca-p软件进行PLS-DA分析，结果如图4所示。由得分矩阵图可知，PLS-DA模型中所有数据点均在95%置信区间内，聚类效果良好，区分明显，说明不同产地的薏苡仁样品在气味化学成分上存在着一定的差异性。启动loading程序，得到荷载散点图，结果如图4-B所示。由图4-B可知，丙烯醛、丙醛、2-丙烯酸、甲苯、2-己醇等成分距离原点中心较远，表明这些成分对分组贡献度较大。PLS-DA模型解释率参数R²_X为0.721，明显高于0.5，说明模型解释率较高。设置分类Y矩阵变量随机排列200次做置换检验，结果如图4-C所示。R²拟合直线在Y坐标轴的截距小于0.3，说明该模型较为可靠，Q²拟合直线在Y坐标轴的截距小于0.05，说明该模型不存在过度拟合的现象。
变量重要性投影值（VIP）可以进一步直观地反映具体变量对模型分类的整体贡献度，在PLS-DA模型中，变量的VIP值大于1.0则说明该变量对整体模型的贡献度高于平均水平，对样本分类的影响具有统计学意义，可以作为差异标志物。使用simca-p软件，启动VIP分析程序，结果如图4-D所示。由图4-D可知，VIP值大于1的气味成分有9个，分别为2-丙烯酸、2-甲基丁醛、甲苯、丙醛、芳樟醇、3-甲基庚醇、α-水芹烯、2,3-乙酰基丙酮、1,2-丁二醇。其中2-丙烯酸、2-甲基丁醛、甲苯、丙醛4种成分的VIP值大于1.2，可视为主要的气味差异标志物。对不同产地薏苡仁的上述4种成分进行单因素方差分析，结果表明P值均小于0.05，具有显著性差异。因此，确定上述4种成分作为不同产地薏苡仁的气味差异标志物。3.3 颜色-气味相关性分析在SPSS 26.0软件中，采用Pearson相关性分析，将表面色度值（L^*、a^*、b^*）与内在气味成分进行相关性分析，旨在为薏苡仁“辨状论质”提供科学依据，结果见表6和图5。在图5中，红色代表正相关，绿色代表负相关，圆圈大小表示相关性强弱。一般认为，相关系数的绝对值大于0.5可认为两者存在显著相关性。根据表6和图5可知，丁二酮、2,3-乙酰基丙酮、3-己醇与L^*值呈正相关且与a^*值、b^*值呈负相关；丙醛与L^*值呈负相关且与b^*值呈正相关；2-丙烯酸与2-己醇与L^*值呈正相关且与b^*值呈负相关；1,2-丁二醇与L^*值呈正相关。上述成分的P值均小于0.05，具有统计学意义。
4 讨论颜色和气味是中药材质量识别的重要指标，但传统的经验鉴别容易受到主观因素的影响。近年来，由于性状电子检测技术具有快速、准确、便捷的特点，能够将传统的外观性状进行客观量化，在中药质量控制方面备受关注。本研究首次采用分光测色技术联用超快速气相电子鼻技术，对不同产地的薏苡仁药材进行快速鉴别研究，并探究薏苡仁外在颜色和内在气味成分的关联性。在颜色测定方面，DT和KNN模型和Bayes判别式均能够有效区分所有产地的薏苡仁。超快速气相电子鼻分析结果显示，同产地的薏苡仁药材之间相似度较高，整体气味信息类似，而不同产地薏苡仁的气味成分则存在较大的差异。同时采用PLS-DA模型成功筛选出4种成分作为鉴别不同产地薏苡仁的气味差异标志物。最后，对颜色和气味进行相关性分析，结果显示薏苡仁的色泽与气味成分之间存在显著关联性。因此，采用分光测色计、超快速气相电子鼻结合化学计量学快速鉴别不同产地薏苡仁是一种快速准确的手段，该方法在多产地中药的质量控制方面具有巨大的应用前景^[28]。

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