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高效液相色谱技能篇|关于方法验证中常见几个概念的小知识(4)

液相色谱(LC)

  • 我们今天接着说:线性
    线性系指在设计的范围内,线性试验结果与试样中被测物浓度直接呈比例关系的能力。应在设计的范围内测定线性关系。可用同一对照品贮备液经精密稀释,或分别精密称取对照品,制备一系列对照品溶液的方法进行测定,至少制备5个不同浓度水平。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图,观察是否呈线性,再用最小二乘法进行线性回归。必要时,响应信号可经数学转换,再进行线性回归计算,或者可釆用描述浓度-响应关系的非线性模型。数据要求:应列出回归方程、相关系数、残差平方和、线性图(或其他数学模型)。
    01.如何确定线性范围?
    1)准备标准溶液:首先需要准备一系列不同浓度的标准溶液,这些溶液应该覆盖预期的线性范围。通常,这包括制备至少五个不同浓度水平的标准溶液,并且每个浓度水平至少进行两次注射以确保重复性。这些浓度通常包括从低浓度到高浓度的一系列值,例如,可以从预期分析物浓度的50%开始,一直到150%。(即50%、80%、100%、120%、150% 5个点)
    2)色谱分析:将这些标准溶液注入HPLC系统进行分析,记录每个溶液的色谱响应信号,如峰面积或峰高。
    3)数据处理:使用适当的数学模型(通常是最小二乘法线性回归分析)来处理数据,建立浓度与响应信号之间的关系。这将产生一个回归方程,包括斜率(slope)、截距(intercept)和相关系数(R2)。
    4)评估线性:检查回归方程的相关系数(R2)以评估线性的好坏。理想情况下,R2值应该接近1,表明在测试的浓度范围内,响应信号与浓度之间存在良好的线性关系。
    5)评估线性的回收率:如果发现回收率有异常,则说明样品量可能存在过载的现象,进行适当的调整,并重新进行线性检测。
    02.如何计算残差平方和?残差平方和是用于衡量模型预测值与实际观测值之间的差异。
    1)计算每个数据点的残差:残差是实际观测值与模型预测值之间的差。
    2)计算残差的平方:将每个残差求平方,以确保所有残差都是非负数,并放大差异。
    3)求和:将所有残差平方相加,得到残差平方和。残差平方和越小,表示模型的预测值与实际观测值之间的差异越小,模型的拟合程度越好。具体示例可以参见高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱技能篇|关于方法验证中常见几个概念的小知识(3)[/url]03.如果残差平方和较大,可能存在哪些问题?如果残差平方和(RSS)较大,这可能意味着模型与数据的拟合程度不够好,一般可考虑的是:
    1)数据中的异常值:异常值会对残差平方和产生较大影响,因为残差是平方计算的。检查数据中是否有异常值或离群点,并考虑对其进行处理或删除。
    2)模型过于简单:如果模型没有足够的参数来捕捉数据中的复杂性,可能会导致高残差平方和。尝试使用更复杂的模型或增加模型的参数。
    3)非线性关系:如果数据实际上并不符合线性模型的假设,强行使用线性模型会导致残差平方和较大。可以考虑使用非线性模型来拟合数据。
    4)数据的异方差性:如果数据的方差不是常数,即存在异方差性,这也会影响残差平方和。可以尝试使用加权最小二乘法或其他方法来处理异方差性。
    5)模型错误指定:如果模型的形式错误,比如应该使用多项式模型却使用了线性模型,也会导致残差平方和较大。重新评估模型的指定,确保它符合数据的实际情况。
    6)数据量不足:如果数据量太少,模型可能无法准确地捕捉到数据的变异性。增加数据量可能会有助于提高模型的拟合度。
    04.如果残差平方和多少算大?多少算小?有没有可接受的标准?抱歉,一般无,它不像R2那样,可以规定不小于0.99之类的;残差平方和(RSS)是衡量模型预测值与实际观测值之间差异,在实际应用中,并没有一个固定的标准来判定是大还是小,因为它受到数据集的大小、数据的变异性以及模型的复杂度等因素的影响。但是大家可以根据自己产品的经验,在不断的方法学验证的过程中积累相关的经验来进行评估,比如以往这类型的方法残差平方和都在0.01左右附近,突然残差平方和变成了1左右,则需要对其进行关注起来。

    (后续讲解......)
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