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高效液相色谱技能篇|关于方法验证中常见几个概念的小知识（4）

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2024/09/13

液相色谱（LC）

我们今天接着说：线性
线性系指在设计的范围内，线性试验结果与试样中被测物浓度直接呈比例关系的能力。应在设计的范围内测定线性关系。可用同一对照品贮备液经精密稀释，或分别精密称取对照品，制备一系列对照品溶液的方法进行测定，至少制备5个不同浓度水平。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算，或者可釆用描述浓度-响应关系的非线性模型。数据要求：应列出回归方程、相关系数、残差平方和、线性图（或其他数学模型）。
01.如何确定线性范围？
1）准备标准溶液：首先需要准备一系列不同浓度的标准溶液，这些溶液应该覆盖预期的线性范围。通常，这包括制备至少五个不同浓度水平的标准溶液，并且每个浓度水平至少进行两次注射以确保重复性。这些浓度通常包括从低浓度到高浓度的一系列值，例如，可以从预期分析物浓度的50%开始，一直到150%。（即50%、80%、100%、120%、150% 5个点）
2）色谱分析：将这些标准溶液注入HPLC系统进行分析，记录每个溶液的色谱响应信号，如峰面积或峰高。
3）数据处理：使用适当的数学模型（通常是最小二乘法线性回归分析）来处理数据，建立浓度与响应信号之间的关系。这将产生一个回归方程，包括斜率（slope）、截距（intercept）和相关系数（R2）。
4）评估线性：检查回归方程的相关系数（R2）以评估线性的好坏。理想情况下，R2值应该接近1，表明在测试的浓度范围内，响应信号与浓度之间存在良好的线性关系。
5）评估线性的回收率：如果发现回收率有异常，则说明样品量可能存在过载的现象，进行适当的调整，并重新进行线性检测。
02.如何计算残差平方和？残差平方和是用于衡量模型预测值与实际观测值之间的差异。
1）计算每个数据点的残差：残差是实际观测值与模型预测值之间的差。
2）计算残差的平方：将每个残差求平方，以确保所有残差都是非负数，并放大差异。
3）求和：将所有残差平方相加，得到残差平方和。残差平方和越小，表示模型的预测值与实际观测值之间的差异越小，模型的拟合程度越好。具体示例可以参见高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱技能篇|关于方法验证中常见几个概念的小知识（3）[/url]03.如果残差平方和较大，可能存在哪些问题？如果残差平方和（RSS）较大，这可能意味着模型与数据的拟合程度不够好，一般可考虑的是：
1）数据中的异常值：异常值会对残差平方和产生较大影响，因为残差是平方计算的。检查数据中是否有异常值或离群点，并考虑对其进行处理或删除。
2）模型过于简单：如果模型没有足够的参数来捕捉数据中的复杂性，可能会导致高残差平方和。尝试使用更复杂的模型或增加模型的参数。
3）非线性关系：如果数据实际上并不符合线性模型的假设，强行使用线性模型会导致残差平方和较大。可以考虑使用非线性模型来拟合数据。
4）数据的异方差性：如果数据的方差不是常数，即存在异方差性，这也会影响残差平方和。可以尝试使用加权最小二乘法或其他方法来处理异方差性。
5）模型错误指定：如果模型的形式错误，比如应该使用多项式模型却使用了线性模型，也会导致残差平方和较大。重新评估模型的指定，确保它符合数据的实际情况。
6）数据量不足：如果数据量太少，模型可能无法准确地捕捉到数据的变异性。增加数据量可能会有助于提高模型的拟合度。
04.如果残差平方和多少算大？多少算小？有没有可接受的标准？抱歉，一般无，它不像R²那样，可以规定不小于0.99之类的；残差平方和（RSS）是衡量模型预测值与实际观测值之间差异，在实际应用中，并没有一个固定的标准来判定是大还是小，因为它受到数据集的大小、数据的变异性以及模型的复杂度等因素的影响。但是大家可以根据自己产品的经验，在不断的方法学验证的过程中积累相关的经验来进行评估，比如以往这类型的方法残差平方和都在0.01左右附近，突然残差平方和变成了1左右，则需要对其进行关注起来。

（后续讲解......）

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