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高效液相色谱基础篇|高效液相色谱的基础概念、色谱图的基础概念和系统适用性的基础概念

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2024/09/29

液相色谱（LC）

今天我们把高效液相色谱中一些相关的专业术语进行梳理一下，方便大家更好的理解，主要分为三个模块：高效液相色谱的基础概念、色谱图的基础概念和系统适用性的基础概念。

01.高效液相色谱的基础概念

1）泵（Pump）：HPLC系统中的泵负责提供恒定的压力和流速，推动流动相通过色谱柱。泵的类型包括等度泵、二元泵、四元泵和双梯度泵，根据分析需求选择合适的泵类型。泵的设计通常要求无脉动地输送溶剂，以确保保留时间的精度。

2）进样器（Autosampler）：进样器用于自动吸取样品并注入色谱柱。它可以提高分析效率，减少人为操作的误差，并允许在无人值守的情况下进行大量样品的分析。进样器的关键部件包括进样针、样品盘和计量装置。

3）色谱柱（Column）：色谱柱是HPLC系统中的主要部件，它通常由不锈钢或玻璃制成，内部填充有固定相。色谱柱的长度、内径和粒径都会影响分离效果。色谱柱的选择取决于分析目标、样品性质和分离要求。

4）检测器（Detector）：检测器用于检测色谱柱流出物中的各个组分。不同类型的检测器对不同的分析物有特定的检测能力。常见的检测器包括紫外-可见光（UVD）、荧光（FLD）、折射率（RID）、蒸发光散射（ELSD）、电化学（ECD）和电雾式（CAD）检测器。检测器的选择取决于样品的特性和分析需求。

5）固定相（Stationary Phase）：固定相是涂覆在色谱柱内填料表面的材料，它可以是硅胶、聚合物或其他化学材料。固定相的化学性质和物理结构决定了与待测样品的相互作用方式，从而影响分离效果。

6）流动相（Mobile Phase）：流动相是携带样品通过色谱柱的液体，通常是水、有机溶剂或它们的混合物。流动相的组成、pH值、温度和流速都会影响分离效果和保留时间。

7）分离模式（Separation Mode）：HPLC中有多种分离模式，包括反相色谱（RP-HPLC）、正相色谱（NP-HPLC）、离子交换色谱（IEC）、尺寸排除色谱（SEC）和亲和色谱等。选择哪种分离模式取决于样品的性质和分析目标。

8）梯度洗脱（Gradient Elution）：在梯度洗脱中，流动相的组成在分析过程中逐渐改变，通常由高到低极性变化。这种方法可以提高分离效率，特别是在分析复杂样品时。梯度洗脱可以通过低压梯度泵或高压梯度泵实现。

9）等度洗脱（Isocratic Elution）：与梯度洗脱相对，等度洗脱是指在整个分析过程中流动相的组成保持不变。等度洗脱通常用于分析组成相对简单的样品，或者当所有分析组分在流动相中具有相似的溶解度时。

10）谱图（Chromatogram）：谱图是HPLC分析的结果图，它显示了样品中各个组分随时间的分布情况。谱图通常由检测器生成，以时间为横坐标，信号强度（如吸光度、荧光强度、电导率等）为纵坐标。每个组分在谱图上表现为一个峰，称为色谱峰。色谱峰的形状、大小和位置可以提供关于样品组分的重要信息，包括其保留时间、峰面积、峰高和峰形等。

02.色谱图的基础概念
1）保留时间（Retention Time）：指从样品注入到色谱柱开始，到某个组分被检测器检测到的时间。保留时间可以用来识别和比较不同的化合物。2）死时间（Dead Time）：死时间是指一个不被色谱柱固定相保留的组分通过色谱柱的时间。它可以用来估算色谱柱的效率。
3）死体积（Dead Volume）：死体积指的是色谱系统中不参与色谱过程的体积，即流动相通过的体积，但不与固定相发生相互作用的空间。这包括了进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。
3）保留因子（Capacity Factor, k）：保留因子是衡量组分在固定相和流动相之间分配平衡的一个参数，定义为组分在固定相中的停留时间与在流动相中的停留时间的比值。
4）峰宽（Peak Width）：峰宽是指色谱图中峰的宽度，它与色谱柱的效率和分离效果有关。峰宽越窄，表示色谱柱的分离效率越高。
5）半峰宽（Full Width at Half Maximum, FWHM）：它指的是色谱峰高一半处的峰宽度。具体来说，是通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离。半峰宽越小，表示色谱峰越窄，通常意味着色谱系统具有更高的分辨率和分离效率。
6）峰面积（Peak Area）：峰面积与样品中组分的量成正比，可以用来进行定量分析。峰面积的测量需要考虑峰的宽度和高度。
7）峰高（Peak Height）：峰高是色谱图中峰的最高点，也可以用来定量分析，但受峰形状的影响较大。
8）峰形（Peak Shape）：峰形是指色谱图中峰的形状，理想的峰形应该是对称的（类似正态分布）。峰形可以反映色谱过程中的一些动力学特性。

V_M：死体积，t_M：死时间
V_R1：峰 1 的保留体积，V_R2：峰 2 的保留体积t_R1：峰 1 的保留时间，t_R2：峰 2 的保留时间W_h：半峰宽；W_i：拐点处的峰宽h：峰高；h/2：半峰高
Peak1：峰1的峰形；Peak2：峰2的峰形
03.系统适用性的基础概念1）理论塔板数（Theoretical Plates, N）：理论塔板数是衡量色谱柱效率的一个参数，它是基于塔板理论来描述色谱柱效能的指标。理论塔板数越多，表示色谱柱的分离效率越高，样品在色谱柱中的分散程度越小。

2）分离度（Resolution, Rs）：分离度是衡量两个相邻色谱峰分离程度的参数，它定义为相邻两峰保留时间之差与两峰宽度之和的比值。分离度越大，表示两个组分的分离越彻底，一般认为分离度大于1.5时，两个组分可以认为是完全分离的。

3）峰谷比（Peak-to-Valley Ratio, PVR）：峰谷比是指在色谱图中，一个峰与其后最近一个低谷之间的信号比值。峰谷比是评价色谱分离效果的一个参数，峰谷比越大，表示两个相邻峰之间的分离越清晰。

4）拖尾因子（Tailing Factor, T）：拖尾因子是描述色谱峰形态的一个参数，它是指峰宽与峰高的比例。拖尾因子大于1表示色谱峰呈现出拖尾现象，这通常是由于样品与固定相之间的相互作用过强或流动相的选择不当造成的。理想的色谱峰拖尾因子接近于1。

5）灵敏度（Sensitivity）：灵敏度是指检测器对样品的响应程度，通常用最小可检测量或检测限来表示。灵敏度越高，表示检测器能够检测到的样品浓度越低，对于痕量分析尤为重要。（一般以信噪比表示）

6）重复性（Repeatability）：重复性是指在相同条件下多次进行色谱分析所得结果之间的一致性。它包括保留时间的重复性、峰面积的重复性等。重复性好的色谱系统能够提供稳定且一致的分析结果。（一般以RSD表示）

总结一下：高效液相色谱（HPLC）是通过泵、进样器、色谱柱、检测器等核心组件来分离和检测样品中的不同组分。在HPLC中，我们关注保留时间、峰宽、峰高和峰形等色谱图参数，以及理论塔板数、分离度、峰谷比、拖尾因子等指标来评估色谱系统的性能。保留时间帮助我们识别化合物，而峰面积和峰高则用于定量分析。分离度和峰谷比告诉我们组分是否得到了有效分离，拖尾因子反映了峰形的对称性。理论塔板数是衡量色谱柱效率的重要参数，而灵敏度和重复性则关系到检测器的性能和分析结果的可靠性。通过优化这些参数，HPLC能够为我们提供精确的分析结果，无论是在研究实验室还是工业生产中都发挥着重要作用。

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