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高效液相色谱基础篇|关于体积排阻色谱柱使用的小知识

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2024/09/29

液相色谱（LC）

在高效液相色谱（HPLC）中，体积排阻色谱柱（Size Exclusion Chromatography, SEC）是一种特殊类型的液相色谱柱，它是基于样品分子的大小，而不是分子之间的相互作用。在体积排阻色谱中，色谱柱的固定相是具有不同孔径的多孔凝胶，这些孔径允许不同大小的分子进入和渗透。

01.体积排阻色谱柱的组成
1）色谱柱管：色谱柱管通常是由不锈钢或玻璃制成的管状结构，用于容纳填料。
2）填料：填料通常由具有不同大小孔隙的多孔凝胶颗粒组成，这些凝胶颗粒是球形的，具有均匀的孔径分布，允许不同大小的分子进入孔隙内部。而SEC色谱柱中的凝胶颗粒通常由惰性聚合物组成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺或交联葡聚糖等。这些材料被设计成具有高度的化学和物理稳定性，以确保它们在色谱过程中不会与样品分子发生非特异性相互作用。
02.体积排阻色谱柱的分离机制样品分子按照从大到小的顺序被洗脱，这是因为大分子不能进入孔隙而被排阻在外，小分子则在孔隙中扩散并被暂时保留。这种分离方式不涉及化学相互作用，如吸附或离子交换，而是基于物理排阻和分子尺寸的差异。大分子：尺寸大于凝胶孔径的分子无法进入孔隙，因此它们沿着柱床的直径路径流动，较早被洗脱，即它们在色谱柱中的保留时间较短。小分子：尺寸小于或能够进入凝胶孔径的分子会深入孔隙内部，因此它们的路径更长，移动速度更慢，从而较晚被洗脱，即它们在色谱柱中的保留时间较长。

03.体积排阻色谱柱与反相色谱柱的差异
1）无相互作用分离：SEC是一种非相互作用色谱技术，这意味着固定相通常不具备与样品分子发生化学反应的能力。分离过程中，样品分子与固定相之间没有或很少有非尺寸排阻的相互作用，如疏水作用、电荷作用或氢键作用。
2）检测灵敏度不是特别高：SEC的灵敏度一般都是μg级别，RP可以达到ng级别。
3）多用于等度洗脱：SEC一般都是等度洗脱，流动相的组成比例和流速保持恒定不变。
4）流动相基本都是中性：流动相通常是中性的，其主要作用是携带样品分子通过色谱柱，并维持凝胶颗粒的稳定性。
5）分离技术较为温和：它特别适合于生物大分子的分析，如蛋白质、多糖和病毒粒子，因为它们在SEC过程中不易变性或失活。而且也常用于聚合物的分子量分布分析。
04.体积排阻色谱柱使用的影响因素
1）样品的分子量和溶解度：样品的分子量需要在色谱柱的分离范围内（这个可以在说明书或者官网上查，比如250A的柱子可以分离多少Da的蛋白质），同时样品需要在流动相中有足够的溶解度，以避免沉淀或吸附。
2）色谱柱填料的选择：填料的孔径大小对分离效果至关重要。选择合适的孔径可以确保不同大小的分子有效分离。
3）流动相的组成：流动相的组成，包括其pH值、离子强度和极性，会影响样品与填料的相互作用，从而影响分离效果。（一般色谱柱说明书中也会写耐受有机相的比例、盐浓度的比例，建议大家不要压着上限使用）
4）温度：温度可以影响样品和填料的稳定性以及样品的溶解度。通常，SEC分离在常温下进行，适当提高温度可以提高柱效和分离度，但不要超过它的耐受温度使用。
5）流速：流速会影响样品在色谱柱中的移动速度，进而影响分离效率和分辨率。流速的选择需要平衡分析时间和分离效果。
6）样品负载：样品的浓度和负载量会影响色谱峰的形状和分辨率。过高的样品负载可能导致峰形变宽和分辨率下降。
7）保存：色谱柱的保存条件会影响其性能。短期保存时，应防止溶剂中的腐蚀性离子损害色谱柱；长期保存时，通常使用含0.05%叠氮化钠的水溶液保存。（叠氮化钠是管制物品，现在一般用proclin进行替代。）
05.体积排阻色谱柱对聚集体分离的局限性
1）分辨率限制：SEC的分辨率相对较低，通常不适合分离分子量差异较小的样品。对于聚集体的分离，SEC通常要求样品中有较大的分子量差异，以便实现有效的分离。
2）分子量差异要求：为了实现有效的分离，样品中分子的分子量差异至少需要在一个数量级以上。然而，这个数值可能会根据具体的色谱柱、样品和实验条件而有所不同。
3）样品的物理特性：SEC对样品的物理特性敏感，如分子的形状和大小。如果聚集体的物理特性与单体相似，可能会导致分离效果不佳。
4）色谱柱的选择：选择合适的SEC色谱柱对于分离聚集体至关重要。色谱柱的孔径和分离范围需要与样品的分子量相匹配。如果色谱柱的选择不当，可能会导致分离效果不佳。

总结一下：体积排阻色谱柱（SEC）在高效液相色谱（HPLC）中就像是个大筛子，主要靠分子的大小来分离它们。这个筛子是由不锈钢或玻璃管组成的，里面装满了小珠子，这些珠子是多孔的，不同大小的孔隙让不同大小的分子要么穿过要么被排阻。大分子因为个头大，进不去孔隙，就沿着柱子外面快速通过，先被洗脱出来；而小分子则能钻进孔隙里，走得慢，后被洗脱。这个过程挺温和的，适合那些容易受伤的大分子，比如蛋白质和聚合物。不过，SEC的分辨率不算高，如果要分离的分子大小差不多，那它可能就分不太清楚了。而且，它的检测灵敏度也不如那些靠分子间作用力来分离的色谱柱，比如反相色谱柱。通常SEC用的是等度洗脱，流动相的组成不变，这样操作起来简单，但分离效果就得看样品和色谱柱合不合拍了。用SEC的时候，还得注意样品的分子量、溶解度、色谱柱的选择、流动相的组成、温度、流速等因素，这些都会影响分离效果。保存色谱柱时也得小心，别让它受潮或者受热，免得影响性能。总的来说，SEC是个简单直接的工具，适合那些需要按大小排序的分子。

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