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高效液相色谱基础篇|关于系统适用性标准考量的小知识

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2024/09/30

液相色谱（LC）

在高效液相色谱仪器学习的过程中，我们总会听到前辈们说这个塔板数降这么多、拖尾因子这么大等等；所以今天我们对高效液相色谱中主要的系统适用性参数进行介绍，方便大家在日常工作中的理解。

01.理论塔板数（N）

这没有可参考的数值，柱效测定的理论塔板数没有任何参考意义，它只是用来评价色谱柱出厂时的性能指标。

假如你测得一个新的色谱柱理论塔板数是20000，与厂家报告的理论塔板数相近（一般在10%左右波动），那么说明色谱柱是没有问题的；如果相差超过30%，我建议你们跟厂家联系，评估色谱柱是否在运输过程中受损。

1）建立该品种下该方法的起始理论塔板数经验值，就像上述说的色谱柱柱效测定的塔板数在实际检测过程中，往往没有那么高，里面受了很多因素的影响（分子与色谱柱填料的相互作用、分子的扩散速率等）。

2）建立该品种下该方法的起始峰宽的经验值，一般来说，一个较好的峰形是符合高斯分布的，而且峰形尖锐、对称；如果峰形从一个瘦高的状态变成了一个矮胖的状态，那说明塔板数也是有变化的

图1.峰形变化图

02.分离度（Rs）

a.除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于 1.5。

b.如果待测物质峰与相邻峰之间未达到基线分离，采用峰谷比

图2.不同分离度的峰形图

1）一般地，满足1.5即可满足基本要求；当分离度小于1时，两色谱峰重叠较严重；分离度等于1(4σ)时，两组分被彻底分离部分占98%，对每个色谱峰来说，其峰纯度亦为98%；分离度为1.5(6σ)时，两组分被彻底分离部分占99.7%。

2）如果峰在主峰后面，主峰后面的峰与主峰的分离度，我建议Rs＞2；因为你要考虑主峰拖尾的情况。
3）峰到谷比也没有明确的推荐值，一般是分离度达不到1.5的时候，才去自己人为的规定；当然了，这也是要基于产品特性的一个数值，比如某方法你在经过一段时间适用后，发现主峰后脚有一个不能完全分离的峰，但通过峰到谷比计算，它都是5.0以上的数值；那么你就可以定峰到谷比＞2；这都是基于自己的历史数据来制定。

图3.不能完全分离的峰形图

03.拖尾因子（T）

a.除另有规定外，在检查和含量测定项下，以峰面积作定量参数时，T 值应在0.8～1.8之间。

b.以峰高作定量参数时，T 值应在0.95～1.05 之间。

1）一般地，当 T>1时，表示色谱峰拖尾；当 T<1时，表示色谱峰前延。

2）建立该品种下该方法的起始拖尾因子经验值，在使用的过程中，色谱柱必然会越用越差，最直接的体现除了理论塔板数的下降，还有拖尾因子的增加。如一开始的峰形对称因子是1.1，在进了2、300针样品后，峰形对称因子变成了1.6；说明在使用的过程中，色谱柱的性能越来越差。我建议超过1.6的时候，就要考虑更换色谱柱了。

不要想着可以再生色谱柱，虽然大家都这么说，实际上有些效果并不理想。

总结一下：在高效液相色谱（HPLC）的学习过程中，我们经常会遇到一些关键的系统适用性参数，比如理论塔板数、分离度和拖尾因子。理论塔板数反映了色谱柱的分离效率，但它主要是色谱柱出厂时的性能指标，实际使用中可能会因多种因素而有所变化。分离度是衡量相邻色谱峰是否充分分离的指标，一般认为分离度大于1.5是可接受的，如果小于1则说明峰之间重叠严重。拖尾因子则用来评价色谱峰的对称性，理想情况下应该接近1，如果大于1.8可能意味着峰形拖尾严重，小于0.8则可能是前延峰。在日常工作中，我们需要建立这些参数的经验值，并根据它们的变化来判断色谱系统的性能。如果发现理论塔板数显著下降或拖尾因子超出了0.8到1.8的范围，可能就是时候考虑更换色谱柱了。毕竟，色谱柱的性能会随着使用而逐渐下降，而且有时候尝试再生色谱柱的效果并不理想。

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