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高效液相色谱基础篇|关于色谱柱平衡的小知识

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2024/09/30

液相色谱（LC）

在高效液相色谱（HPLC）中，色谱柱平衡是一个非常重要的步骤。当把一个 HPLC 系统打开运行，流动相就开始流动，在可以使用系统进行样品进样之前一般需要 30-60 分钟的平衡时间（主要是把色谱柱中的保存溶液替换成流动相）。

01.色谱柱平衡的概念

在进行色谱分析之前，使用流动相通过色谱柱，使色谱柱内部的填料与流动相达到一个稳定状态的过程。

02.色谱柱平衡的目的

为了确保色谱柱的稳定性和重复性，并减少色谱柱与流动相之间的相互作用，从而获得更准确的分析结果。

03.色谱柱平衡的一般步骤

1）选择合适的流动相：根据分析物的性质选择合适的流动相，确保流动相与色谱柱的填料相容，避免使用对色谱柱有害的溶剂。

2）冲洗色谱柱：用流动相冲洗色谱柱，以去除柱内可能存在的杂质和残留物。冲洗的时间和流速应根据色谱柱的说明书和分析要求进行。

3）平衡色谱柱：用流动相平衡色谱柱，使柱内填料充分润湿并与流动相达到平衡状态。平衡的时间和流速也应根据色谱柱的说明书和分析要求进行。需要注意的是，在平衡色谱柱时，应避免使用过高的流速和过高的压力，以免对色谱柱造成损害。此外，在平衡过程中，应定期检查色谱柱的出口端是否有气泡产生，如果有气泡，应及时排除，以免影响分析结果。

04.色谱柱平衡的确认方式

1）基线稳定性：通过观察检测器的基线是否平稳，没有大的波动，可以判断色谱柱是否达到平衡。如果基线长时间保持稳定，说明色谱柱已经平衡。

2）压力稳定性：色谱柱的压力读数在一段时间内保持恒定，没有出现突然的升高或降低，这通常表明色谱柱已经平衡。

3）色谱峰的一致性：如果连续进样几次，色谱峰的保留时间、峰形和峰面积等参数保持一致，说明色谱柱已经平衡。

4）进行系统适用性测试：使用系统适用性测试样品进行分析，检查理论板数、拖尾因子和分离度等参数是否符合要求。

05.色谱柱平衡的注意事项

1）流动相选择：确保流动相的组成与分析目的相匹配，并且与色谱柱的填料相容。
2）平衡时间：给予色谱柱足够的时间来平衡，特别是如果之前使用的流动相与将要使用的流动相差异较大时。
3）流速控制：在开始平衡时，使用较低的流速，然后逐渐增加到所需的流速，以避免对色谱柱造成突然的压力冲击。
4）基线观察：在平衡过程中，密切观察检测器的基线，直到它变得稳定，这通常意味着色谱柱已经达到平衡。
5）压力监控：在平衡过程中监测柱压，确保它在色谱柱的工作压力范围内，并注意任何异常的压力变化。
6）避免气泡：在平衡过程中，确保色谱柱中没有气泡，因为气泡可能会影响色谱性能并损坏色谱柱。
7）柱温和流动相温度：保持柱温和流动相温度恒定，因为温度的变化可能会影响色谱柱的平衡状态。
8）梯度洗脱：如果使用梯度洗脱，确保在梯度运行之后给予色谱柱足够的时间回到初始条件，并保持稳定。
9）避免频繁切换：避免频繁切换流动相的组成，因为这可能会导致色谱柱性能不稳定。
10）避免盐析出：当使用含盐的流动相时，要注意在平衡前后使用适当的溶剂比例过渡，以避免盐析出。

总结一下：

在高效液相色谱（HPLC）中，色谱柱平衡是分析前的一个关键步骤，它的目的是让色谱柱内部的填料与流动相充分接触，达到稳定状态，以确保分析的稳定性和重复性。简单来说，就是用流动相把色谱柱里原来的保存液换成我们要用的流动相，具体时间取决于色谱柱和流动相的特性。

要确认色谱柱是否平衡，我们可以看几个方面：首先，检测器显示的基线要平稳，没有大的波动；其次，色谱柱的压力要稳定，不能有突然的升高或降低；再就是连续进样几次，色谱峰的保留时间、峰形和峰面积等参数要一致；最后，可以进行系统适用性测试，看看分离度等参数是否符合要求。

在平衡色谱柱时，要注意选择正确的流动相，给色谱柱足够的时间来平衡，特别是如果之前用的流动相和现在的不一样。开始时要先用较低的流速，然后慢慢增加到需要的流速，避免对色谱柱造成压力冲击。同时，要密切关注基线和压力的变化，确保没有气泡产生，保持柱温和流动相温度的恒定，特别是在使用梯度洗脱时，要确保色谱柱有足够的时间回到初始状态。避免频繁更换流动相，以免影响色谱柱的性能。如果流动相中含有盐，还要注意在平衡前后使用适当的溶剂比例，防止盐析出。

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