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高效液相色谱基础篇|关于色谱柱平衡的小知识

液相色谱(LC)

  • 在高效液相色谱(HPLC)中,色谱柱平衡是一个非常重要的步骤。当把一个 HPLC 系统打开运行,流动相就开始流动,在可以使用系统进行样品进样之前一般需要 30-60 分钟的平衡时间(主要是把色谱柱中的保存溶液替换成流动相)。

    01.色谱柱平衡的概念

    在进行色谱分析之前,使用流动相通过色谱柱,使色谱柱内部的填料与流动相达到一个稳定状态的过程。

    02.色谱柱平衡的目的

    为了确保色谱柱的稳定性和重复性,并减少色谱柱与流动相之间的相互作用,从而获得更准确的分析结果。

    03.色谱柱平衡的一般步骤

    1)选择合适的流动相:根据分析物的性质选择合适的流动相,确保流动相与色谱柱的填料相容,避免使用对色谱柱有害的溶剂。

    2)冲洗色谱柱:用流动相冲洗色谱柱,以去除柱内可能存在的杂质和残留物。冲洗的时间和流速应根据色谱柱的说明书和分析要求进行。

    3)平衡色谱柱:用流动相平衡色谱柱,使柱内填料充分润湿并与流动相达到平衡状态。平衡的时间和流速也应根据色谱柱的说明书和分析要求进行。需要注意的是,在平衡色谱柱时,应避免使用过高的流速和过高的压力,以免对色谱柱造成损害。此外,在平衡过程中,应定期检查色谱柱的出口端是否有气泡产生,如果有气泡,应及时排除,以免影响分析结果。

    04.色谱柱平衡的确认方式

    1)基线稳定性:通过观察检测器的基线是否平稳,没有大的波动,可以判断色谱柱是否达到平衡。如果基线长时间保持稳定,说明色谱柱已经平衡。

    2)压力稳定性:色谱柱的压力读数在一段时间内保持恒定,没有出现突然的升高或降低,这通常表明色谱柱已经平衡。

    3)色谱峰的一致性:如果连续进样几次,色谱峰的保留时间、峰形和峰面积等参数保持一致,说明色谱柱已经平衡。

    4)进行系统适用性测试:使用系统适用性测试样品进行分析,检查理论板数、拖尾因子和分离度等参数是否符合要求。

    05.色谱柱平衡的注意事项

    1)流动相选择:确保流动相的组成与分析目的相匹配,并且与色谱柱的填料相容。
    2)平衡时间:给予色谱柱足够的时间来平衡,特别是如果之前使用的流动相与将要使用的流动相差异较大时。
    3)流速控制:在开始平衡时,使用较低的流速,然后逐渐增加到所需的流速,以避免对色谱柱造成突然的压力冲击。
    4)基线观察:在平衡过程中,密切观察检测器的基线,直到它变得稳定,这通常意味着色谱柱已经达到平衡。
    5)压力监控:在平衡过程中监测柱压,确保它在色谱柱的工作压力范围内,并注意任何异常的压力变化。
    6)避免气泡在平衡过程中,确保色谱柱中没有气泡,因为气泡可能会影响色谱性能并损坏色谱柱。
    7)柱温和流动相温度:保持柱温和流动相温度恒定,因为温度的变化可能会影响色谱柱的平衡状态。
    8)梯度洗脱:如果使用梯度洗脱,确保在梯度运行之后给予色谱柱足够的时间回到初始条件,并保持稳定。
    9)避免频繁切换:避免频繁切换流动相的组成,因为这可能会导致色谱柱性能不稳定。
    10)避免盐析出:当使用含盐的流动相时,要注意在平衡前后使用适当的溶剂比例过渡,以避免盐析出。



    总结一下:

    在高效液相色谱(HPLC)中,色谱柱平衡是分析前的一个关键步骤,它的目的是让色谱柱内部的填料与流动相充分接触,达到稳定状态,以确保分析的稳定性和重复性。简单来说,就是用流动相把色谱柱里原来的保存液换成我们要用的流动相,具体时间取决于色谱柱和流动相的特性。

    要确认色谱柱是否平衡,我们可以看几个方面:首先,检测器显示的基线要平稳,没有大的波动;其次,色谱柱的压力要稳定,不能有突然的升高或降低;再就是连续进样几次,色谱峰的保留时间、峰形和峰面积等参数要一致;最后,可以进行系统适用性测试,看看分离度等参数是否符合要求。

    在平衡色谱柱时,要注意选择正确的流动相,给色谱柱足够的时间来平衡,特别是如果之前用的流动相和现在的不一样。开始时要先用较低的流速,然后慢慢增加到需要的流速,避免对色谱柱造成压力冲击。同时,要密切关注基线和压力的变化,确保没有气泡产生,保持柱温和流动相温度的恒定,特别是在使用梯度洗脱时,要确保色谱柱有足够的时间回到初始状态。避免频繁更换流动相,以免影响色谱柱的性能。如果流动相中含有盐,还要注意在平衡前后使用适当的溶剂比例,防止盐析出。
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