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高效液相色谱基础篇|关于反相色谱柱使用的小知识

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2024/09/30

液相色谱（LC）

在高效液相色谱（HPLC）中，反相色谱柱（Reverse Phase Column，简称RPC）是一种常用的色谱柱，其特点是使用非极性的固定相和极性的流动相进行分离。
01.反相色谱柱的组成1）固定相（Stationary Phase）：

固定相通常是通过在硅胶基质上键合疏水性官能团来构建的，这些官能团可以是C18（十八烷基）、C8（辛基）、C4（丁基）或苯基等（C18、C8、C4的选择可参见高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱|反相色谱小知识-常见的固定相种类[/url]）。这些官能团提供了非极性的作用表面，与样品中的疏水性分子相互作用。（固定相的疏水性与样品分子的疏水性之间的作用力是分离过程中的关键因素。）

2）色谱柱管（Column Tube）：

色谱柱管通常由不锈钢或特殊塑料制成，以容纳填料并保证溶剂流动。柱管的内壁可能经过特殊处理，以减少样品与管壁的相互作用。

3）填料（Particle Filler）：

填料是固定相的载体，通常是球形硅胶颗粒，它们可以提供大量的表面积以供键合疏水性官能团。填料的粒径、孔径和形态（如球形、无定形）会影响色谱柱的效率和分离能力。

4）封端技术（End Capping）：

为了减少硅胶基质上的游离硅羟基与极性组分的相互作用，提高色谱峰的对称性，通常会采用封端技术。封端可以减少色谱峰拖尾，提高柱效和重现性。

02.固定相与流动相的作用
1）固定相（Stationary Phase）的作用：
a. 提供相互作用表面：固定相具有特定的化学性质（如疏水性），能够与样品中的不同分子产生相互作用，如吸附、离子交换或化学键合等。
b. 分离基础：固定相的化学和物理性质是实现样品分离的基础。在反相色谱中，固定相通常是疏水性的，与样品中的疏水性分子相互作用较强。
c. 影响保留时间：固定相的性质直接影响样品分子在色谱柱中的保留时间，即分子在色谱柱中移动的速度。
2）流动相（Mobile Phase）的作用：
a. 携带样品通过色谱柱：流动相是推动样品分子通过色谱柱的介质，通常是一种或多种溶剂的混合物。
b. 调整分离选择性：通过改变流动相的组成（如有机溶剂和水的比例）、极性或pH值，可以调整样品分子与固定相之间的相互作用强度，从而影响分离效果。
c. 影响保留时间和选择性：流动相的极性越强，疏水性分子与固定相的相互作用越弱，分子的保留时间越短。反之，流动相的极性越弱，保留时间越长。
d. 影响色谱峰的形状：流动相的组成和性质还会影响色谱峰的对称性和分辨率。

03.反相色谱柱的分离机制

1）疏水作用：

在RPC中，固定相通常是高度疏水的，这意味着它不易与水分子相互作用。样品中的溶质分子根据它们的疏水性（即它们逃避水的倾向）与固定相的疏水基团相互作用。

2）分子与固定相的相互作用：

疏水性越强的分子越倾向于与固定相的疏水基团相互作用，因此它们在色谱柱中的移动速度较慢。这些分子在色谱柱中的保留时间较长，因为它们需要更多的时间才能被流动相洗脱。

04.反相色谱柱使用的影响因素

1）色谱柱的选择：色谱柱的固定相类型（如C18、C8、C4等）对分离效果有显著影响。不同的固定相有不同的疏水性，影响样品的保留时间。

2）流动相的组成：流动相的极性对样品的保留和分离至关重要。通常，流动相由水和有机溶剂（如甲醇、乙腈等）组成，通过调整有机溶剂的比例来控制样品的保留时间。

3）柱长：柱长对分离效率有影响，通常有机小分子和肽类的分辨率随柱长的增加而增加，但对于蛋白质和核酸等大分子，较短的柱子也可获得良好的分离效果。

4）色谱柱的填料粒径：填料粒径影响柱效和分离速度，较小的粒径可以提高柱效，但可能会增加柱压。

5）色谱柱的封端技术：封端技术可以减少样品与色谱柱中未反应的硅羟基的相互作用，改善峰形，特别是对于碱性化合物。

6）流动相的流速：流速对分辨率有显著影响，流速越小，色谱峰越宽，分辨率越低。流速的选择对制备色谱尤为重要。

7）温度：温度的升高可以降低流动相的粘度，加快流动速度，提高传质速度，从而提高分辨率。但温度升高也可能导致疏水性作用减弱，影响分离效果。

8）样品的pH值：调节流动相的pH值可以影响样品组分的解离状态，增加组分在固定相上的保留，改善峰形，特别是在分析弱酸或弱碱样品时。

9）样品的溶解度：样品在流动相中的溶解度应适宜，以避免在柱头沉淀，影响分离效果；必要时增加保护柱。

总结一下：

简单来说，反相色谱柱在高效液相色谱中是用来分离不同疏水性分子的。它的固定相是一些疏水性的官能团，比如C18，它们就像一些小小的非极性的“粘性”表面，能够抓住样品中的疏水分子。

而流动相则是偏极性的溶剂混合物，比如含有水和有机溶剂，它的作用是带着样品分子穿过色谱柱。通过调整流动相的组成和比例，我们可以控制样品分子在色谱柱中的移动速度，从而实现分离。

色谱柱的性能还受到柱长、填料粒径、封端技术、流速、温度和样品pH值等因素的影响。这些因素就像调节旋钮，通过它们可以优化分离效果，让不同的分子按照我们希望的方式分开。

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