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【第十七届原创】豆芽中6-BA的测定

我是风儿

2024/10/06

豆芽中6-BA的测定

BJS 201703中的原理及前处理方法

试样经含1%甲酸的乙腈溶液匀浆提取，脱水，离心后，上清液经分散固相萃取净化，用高效液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。

提取

准确称取 10.0 g（精确至0.01 g）试样置于 50 mL 具塞离心管中，加入 20 mL 含1%甲酸的乙腈溶液，高速匀浆 2 min，加入 4 g 无水硫酸镁和 1 g 无水乙酸钠，立即涡旋混合 1 min，以 10000 r/min 离心 5 min使乙腈和水相分层。

净化

精密量取上层乙腈溶液 4 mL 置于 QuEChERS 离心管（含 300 mg 无水硫酸镁和 100 mg C18）（4.8）中，涡旋混合 2 min，以14000 r/min 离心 5 min，移取全部上清液于 15 mL 离心管中，于 45 ℃水浴中氮吹至近干，用甲醇定容至 1 mL，涡旋混匀 1 min，以 14000 r/min 离心 5 min，上清液经 0.22 μm 有机相滤膜过滤后，取续滤液供高效液相色谱-串联质谱测定。

基质混合标准工作溶液：

空白基质提取液：称取空白试样各10.0 g（精确至0.01 g），分别置于50 mL具塞离心管中，自“加入20 mL含1%甲酸的乙腈溶液”起与样品同法处理（提取和净化），作为空白基质提取液。

分别精密量取混合标准中间液6-BA（1 μg/mL）0 μL、10 μL、20 μL和40 μL，及标准中间液6-BA（10 μg/mL）10 μL、15 μL和20 μL，用空白基质提取液定容至1.0 mL，作为基质混合标准工作溶液S0、S1—S6。浓度依次为0 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL和200 ng/mL，或依需要配制适当浓度的基质混合标准工作溶液。临用新制。

然而在实际检测中，发现采用来源不同的豆芽空白基质，同样浓度的标液在空白豆芽基质中的响应各异，这样就造成了样品的加标回收率各异（25～200）%，非常不稳定

前处理改进后

原理

豆芽经酸性乙腈提取，盐析、离心、浓缩、复溶，经MCS 固相萃取柱净化,用甲醇、5%氨化甲醇分别洗脱，浓缩后分别用UPLC-MS/MS 测定，外标法定量。MCS 固相萃取柱：规格为500mg/6mL（SILICA+阳离子交换树脂）

样品处理及分析

样品采集：

样品采集的标准化是获得准确数据的基础，抽样必须是随机的和有代表性的，能反映出样品的真实情况。同时采集植物生长调节剂空白果蔬同样进行样品提取、净化，用于标准曲线制备。

试样的制备和保存：

将待测果蔬样品粉碎混匀待用,称取试样后将剩余试样放置于-20℃冰箱中保存备用，尽快分析。

提取：

称取试样5.00g于50ml 离心管中，加入20μL甲酸，再加入20mL乙腈，漩涡混匀1min左右，然后超声5min,超声结束冷却后10000rpm离心机离心5min，上清液转移至新的50ml离心管中，然后加入2.0gNaCl(使其饱和有结晶)，漩涡混匀2min后10000rpm离心2min，吸出2mL乙腈相入试管中，50℃下用氮气吹干，加入0.2mL甲醇漩涡溶解，再加入 3mL 40mmol/L的盐酸溶液混匀，转移至离心管内，15000rpm离心机离心5min，分出上清液待净化。

净化：

先用5mL甲醇、5mL水、5mL 40mmol/L的盐酸溶液活化MCS柱(MCS 固相萃取柱：规格为500mg/6mL（SILICA+阳离子交换树脂）)，活化结束后，上清液转移到MCS柱内，待样品过柱后，用5ml水淋洗除杂，真空抽干5min，加入5mL甲醇洗脱收集于10ml具塞试管内，抽干；再用5mL5mL5%氨化甲醇洗脱，收集于10mL具塞试管内，得洗脱液；洗脱液在50℃下用氮气吹干，加入0.1mL甲醇超声溶解残留物，再加入0.9mL10%甲醇/水溶液混匀，过0.22μm滤膜后待UPLC-MS/MS 分析。

5 测定

5.1 仪器参考条件

5.1.1 液相色谱参考条件

（a）色谱柱：Waters BEH C18 柱（1.7μm，2.1mm×100mm）或相当色谱柱；柱温：40℃。

（b）流动相分别采用 A 为 5mmol/L 的乙酸铵溶液，B 为乙腈，参考梯度洗脱：

0-1min，2%B；1-2min，30%B；2-4min，95%B；4-5min，95%B；5-6min，2%B；6-8min，2%B。

（c）流速：0.3mL/min。

（d）进样体积：2-5μL（视仪器灵敏度）。

5.1.2 质谱仪参考条件

（a）离子源：电喷雾离子源（ESI）。

（b）毛细管电压：0.5kv；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：400℃。

（c）扫描方式：负离子扫描；

（d）检测方式：多反应检测（MRM）。

（e）雾化气、气帘气、辅助加热气由氮气发生器产生或使用高纯氮气、碰撞气均为高纯氩气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。

（f）锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最优灵敏度。

（g）定量离子对、定性离子对、锥孔电压及碰撞能量参考参数见表1。

表 1 10 种植物生长调节剂参考质谱参数

化合物

保留时间

（min)

定量离子对（锥孔电压 V、碰撞能量 eV）

定性离子

（锥孔电压 V、碰撞能量 eV）

6-BA

3.23

224.0>133.1(15,36)

224.0>106.2(15,21)

标准曲线的制作

取0.01mL、0.02mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL 100.0 ng/mL植物生长调节剂混合应用液，再加入10%甲醇/水溶液定容至 1.0mL 混匀，制备成6-BA含量 1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL 标准溶液，供 UPLC-MS/MS 分析后绘制标准曲线。

注意事项

由于果蔬特别是豆芽中基质复杂，干扰物质多，基质经上述方法处理后对6-BA定量影响不明显，因此不存在采用不同来源的空白豆芽基质，同样浓度的标液在不同来源的空白豆芽基质中响应相差很大的干扰，回收率相对稳定多了，可满足60%—120%。

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zyl3367898

第1楼2024/10/08

应助达人

很好的改良方法，老师真棒，我们也试试

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