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高效液相色谱方法验证篇|关于专属性考量的小知识

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2024/10/21

液相色谱（LC）

今天开始讲一下液相分析方法验证相关的一些小知识，并结合最新的ICH Q2的要求，方便大家在新的指导政策下把方法验证做的更加完善。之前已讲了方法验证中专属性的概念（详见液相色谱技能篇|关于方法验证中常见几个概念的小知识_https://bbs.instrument.com.cn/topic/8409823），这里就不做过多的描述。

01.专属性里的两个概念

ICH Q2原文：

专属性（Specificity）通常指的是分析方法能够区分目标分析物和其他潜在干扰物质（如杂质、降解产物、辅料等）的能力。一个具有高专属性的分析方法可以确保在存在这些潜在干扰物质的情况下，仍然能够准确地测定目标分析物。

选择性（Selectivity）则是描述分析方法在混合物或基质中特定被分析物可以被检测且不受具有类似行为的其他组分干扰的程度。选择性是一个相对术语，它强调了在特定条件下分析方法对目标分析物的测定能力，即使在其他组分可能存在的情况下。

这两个概念的关注点略有不同：

a. 专属性更侧重于分析方法在面对潜在干扰物质时的区分能力，这些干扰物质可能与目标分析物结构相似或在样品中共存。

b. 选择性则更侧重于分析方法在特定条件下对目标分析物的测定能力，即使在其他组分可能存在的情况下。

02.专属性的策略

1）干扰物的识别和评估专属性：专属性要求分析方法能够区分目标分析物和其他潜在干扰物质（如杂质、降解产物、辅料等）。通过在样品中加入这些潜在干扰物来验证方法是否能准确测定目标分析物而不受到干扰。选择性：选择性侧重于分析方法在特定条件下对目标分析物的测定能力，即使在其他组分可能存在的情况下。选择性意味着方法能够在复杂的样品基质中识别并测定目标分析物。
2）采用正交方法比较专属性：在专属性不强的情况下，可以采用另一种不同原理的分析方法来补充，以证明方法的专属性。例如，使用不同的色谱柱或流动相条件来优化分离效果。选择性：通过与另一种已验证的方法比较结果，来证明分析方法的选择性，尤其是在无法获得杂质或降解产物对照品时。正交方法通过使用基于不同保留机制的分离模式（如HPLC与CE、GC或SFC）来确保样品成分的完全分离。
3）技术固有合理性专属性：某些分析技术的专属性可以通过技术参数来确保，如质谱中的同位素分辨率。如果这些技术参数被证明是合理的，则可能不需要额外的实验研究来证明专属性。选择性：选择性也与技术参数有关，但更侧重于方法在特定应用条件下的表现。例如，通过质谱检测的选择性来确保分析方法的有效性。
4）数据要求专属性：需要提供数据证明方法在存在潜在干扰物时的准确测定能力。通常包括代表性图谱、分离度、峰纯度检查等。选择性：需要提供数据证明方法在复杂样品中对目标分析物的选择性测定能力。数据要求包括回归方程、相关系数、残差平方和、线性图等。
5）色谱法和其他分离方法专属性：色谱法中的分离度应符合要求，且应附代表性图谱说明方法的专属性。在杂质对照品可获得的情况下，可以向供试品中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰。选择性：选择性同样依赖于色谱或其他分离方法的有效性，但更强调在复杂样品中区分目标分析物的能力。通过改变色谱柱类型或流动相条件来优化分离效果。
6）强制降解试验专属性：通过强制降解试验来评估降解产物对分析方法的影响，确保方法的专属性。采用强光照射、高温、高湿、酸（碱）水解或氧化的方法进行强制破坏。选择性：强制降解试验也用于评估选择性，尤其是在无法获得降解产物对照品时。通过模拟样品在剧烈条件下的降解，研究可能的降解产物对分析结果的影响。
7）峰纯度检查专属性：使用如光电二极管阵列检测和质谱检测等技术进行峰纯度检查，以确认色谱峰中是否只包含目标分析物。选择性：峰纯度检查也用于评估选择性，确保在复杂样品中目标分析物的色谱峰纯度。通过二极管阵列检测器（DAD）或质谱（LC-MS）进行峰纯度扫描。
8）加样回收试验专属性：通过向已知被测成分含量的供试品中加入已知量的杂质或辅料，来评估方法的专属性。考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质或辅料的样品进行比较。选择性：加样回收试验同样可以用于评估选择性，尤其是在复杂样品中。通过向样品中加入已知量的目标物质，然后测定回收率，以验证分析方法的准确度。
9）本底扣除专属性：如果样品本底会产生干扰，通过有效的本底扣除可以证明方法的专属性。进行本底扣除后，如果方法能准确测定目标分析物，这表明即使在有潜在干扰物存在的情况下，方法也能正确工作，因此认为专属性通过。选择性：通过本底扣除可以展示方法的选择性。如果本底扣除后，分析方法能够准确测定目标分析物，即使在样品基质复杂或存在潜在干扰物的情况下，也表明方法具有良好选择性。

总结一下：

在液相分析方法验证中，专属性和选择性是两个核心概念。专属性是指分析方法能够准确地区分目标分析物和可能存在的干扰物质，比如杂质或降解产物。而选择性则是指在样品中其他成分存在的情况下，方法仍然能够准确测定目标分析物的能力。要验证这两个特性，我们可以采取一些策略，比如识别和评估潜在的干扰物，使用不同原理的分析方法进行比较，或者通过技术参数来确保方法的专属性。此外，我们还需要提供数据来证明方法在存在干扰物时的准确测定能力，这可能包括色谱图、分离度、峰纯度检查等。在实际操作中，我们可能会通过加入已知量的干扰物来测试方法的专属性，或者通过与另一种成熟的方法比较来验证选择性。强制降解试验、峰纯度检查和加样回收试验都是验证这两种特性的常用手段。有时候本底扣除也是一个重要的步骤，可以帮助我们从总信号中去除背景干扰，从而更准确地测定目标成分。总的来说，专属性和选择性是确保我们的分析方法在面对复杂样品时，依然能够准确、可靠地工作的两个关键因素。通过这些验证策略，我们可以确保分析方法在实际应用中的有效性和可靠性。

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