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[font=宋体]在免疫学的世界中,抗原的选择是至关重要的。近年来,许多研究者提出了各种不同的抗原类型以供选择,其中最引人注目的两种是蛋白抗原和多肽抗原。这两种抗原各有其独特的优势和特点,那么,如何在这两者之间做出选择呢?本文将为您详细解析两者的差异以及应用场景,帮助您在免疫学研究中做出最佳的选择。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]①为什么选择蛋白抗原免疫?[/font][/b][font=宋体]您需要一种适用于多种应用的抗体[/font][font=宋体]您的目标蛋白与其他蛋白的序列相似性低,易于表达和纯化,且无毒[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]适用于以下应用:[/font][font=宋体][font=Calibri]Western Blot[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IP/ChIP[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]……[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]②为什么选择多肽抗原免疫?[/b][/font][font=宋体][font=宋体]您的预期抗体应用仅包括[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]或翻译后修饰检测。[/font][/font][font=宋体]您的目标蛋白与其他蛋白具有高度的序列相似性,很难或不可能表达和纯化。[/font][font=宋体]适用于以下应用:[/font][font=宋体][font=Calibri]Western Blot[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]PTM Detection[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]多肽抗原是基于天然靶蛋白的序列精心选择的短氨基酸序列。[/font] [font=宋体]当目标蛋白的获取受限时,多肽是一种合适的解决方案。[/font] [font=宋体]它们也是检测靶蛋白翻译后修饰([/font][font=Calibri]PTM[/font][font=宋体])位点的理想抗原,因为它们限制了潜在表位的数量。 虽然潜在表位少对于大多数抗体项目和应用来说是缺点,但是当产生[/font][font=Calibri]PTM[/font][font=宋体]抗体时,有限数量的表位使得发现仅针对[/font][font=Calibri]PTM[/font][font=宋体]位点的反应性抗体更易。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]多肽抗原的局限性:[/b][/font][font=宋体][font=宋体]多肽抗原由于其价格低和周期短而具有吸引力,但更重要的是要考虑它的局限性。蛋白质抗原能够诱导针对构象表位的抗体,而针对肽抗原的抗体只能识别线性表位。尽管多肽产生的抗体可以在其他应用中起作用。但多肽抗原的价值主要体现在翻译后修饰检测抗体的制备。例如,抗多肽抗体可以应用于[/font][font=Calibri]Western blots[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]。然而,线性化蛋白必须包括用于免疫的固有线性多肽抗原的表位,以确保阳性结果。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/antigen-preparation-services][b]蛋白抗原和多肽抗原制备服务[/b][/url],有需求可以直接咨询,详情请看:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/antigen-preparation-services[/font][/font]
1.多肽合成的基本原理?多肽固相合成法是多肽合成化學的一個重大的突破。它的最大特點是不必純化中間產物,合成過程可以連續進行,進而為多肽合成的自動化奠定了基礎。目前全自動多肽的合成,基本都是固相合成。其基本過程如下:基於Fmoc化學合成,先將所要合成的目標多肽的C-端氨基酸的羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連,然後以這一氨基酸的氨基作為多肽合成的起點,同其他的氨基酸已經活化的羧基作用形成肽鍵,不斷重複這一過程,即可得到多肽。根據多肽的氨基酸組成不同,多肽後處理方式不同,純化方式也有差異。2.做免疫用的多肽多長為合適?答:一般約10-15個氨基酸,當然長一些免疫效果好一些,不過合成費用也會增加。MAP多肽則希望長度在15aa以上,效果較好。另外,10aa以下的多肽免疫效果比較差。3.免疫用多肽的純度需要很高嗎?答:一般而言, 免疫用Peptide,70-85%即可。4.我們合成的多肽溶解性不好,多肽就有問題對嗎?答:很難準確預測一個多肽的溶解性及合適的溶劑是什麼。如果多肽難以溶解就認為多肽合成有問題這個觀念並不正確。5.多肽狀態是如何?如何保存儲存?答:我們提供的多肽是粉末狀,一般為灰白色,組成不同,多肽粉末的顏色有差異,多肽一般長期保存需要避光保存,並應保存在-20度,短期可以保存在4度。可以短時間的話是以室溫運輸。6.如何溶解多肽?答:溶解多肽是非常複雜的事情,一般很難一下子確定合適的溶劑。通常是先取一點試驗,在沒有確定合適的溶劑前千萬不要合部溶解。下列方法有助於您選擇合適的溶劑:(1)判定多肽的電荷特定,設定酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH為-1;鹼性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2為+1,其他氨基酸的電荷為0。計算出將電荷數。(2)如果淨電荷數 0,多肽為鹼性,用水溶解:如果不溶解或溶解性不大,加入醋酸(10%以上);如果多肽還不能溶解,加入少量TFA(25ul)溶解,然後加入500ul水稀釋。(3)如果淨電荷數0,多肽為酸性,用水溶解;如果不溶解或溶解性不大,加入氨水(25ul)溶解,然後加入500ul水稀釋。(4)如果淨電荷數=0,多肽為中性,一般需要用有機溶劑如乙腈,甲醇或異丙醇,DMSO等溶解。還有人建議需要尿素來溶解疏水性很大的多肽。7.非HPLC純化的多肽中有哪些雜質?答:粗品和脫鹽級別的多肽中多肽和非多肽類雜質:如非全長多肽和多肽後處理的一些原料如DTT、TFA等8.HPLC純化的多肽有哪些雜質?答:經過HPLC純化的多肽,仍會有一些一些雜質存在,其中的雜質主要是短肽和微量TFA。9.多長的多肽為合適?答:多肽合成需要考慮多肽的長度,電荷,親疏水性等因素。長度越長,合成粗品的純度和產率都隨著降低,純化的難度和無法合成的幾率就會大些。當然多肽功能區的序列是無法改變的,但是為了多肽的順利合成,有時不得不在功能取的上下游增加一些輔助氨基酸,以改善多肽的溶解性和親疏水性。如果多肽太短,合成也可能有問題,主要問題是合成的多肽在後處理過程中有一定的難度,5肽以下的多肽,一般要有疏水的氨基酸,否則後處理難度加大。15個氨基酸殘基以下的多肽一般都可以得到滿意的產率和得率。10.如何從多肽序列中判定多肽的溶解性?(1)多肽中如果含有高比例的疏水性很強的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp,多肽很難溶解與水性溶液中或根本不可能溶解。這些氨基酸無論是純化或合成,都有可能有問題。(2)一般情況下疏水性氨基酸的比例50%,不能連續5個連續aa為疏水性,帶電荷的氨基酸的(正電荷K,R,H,N-terminus,負電荷D,E,C- terminus)的比例達到20%,在多肽的N或C短如果能增加極性氨基酸,也可以改善溶解性。11.為什麼含有Cys,Met,或Trp的多肽難合成?答:含有Cys, Met,或Trp的多肽難以合成,同時難以獲得高純度的產品。主要因為這些基團不穩定,易氧化。這些多肽的使用和儲存都需要特別注意,避免反復開啟蓋子。12.為什麼有些多肽的合成產率或純度會比較低?答:多肽合成與引子合成有比較大的區別,不能合成的引子很少,但是不能合成的多肽經常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr這些氨基酸比鄰或重複時,多肽鏈在合成過程中不能完全舒展溶解,合成效率下降。以下幾種情形,合成效率和產物的純度都比較低,如:重複Pro,Ser-Ser,重複Asp,4個連續Gly等.13.多肽是如何純化的?答:多肽純化一般使用反相柱(如C8,C18等),214nm。緩衝體系通常為含TFA的溶劑,pH 2.0 。Buffer A為含0.1%TFA in ddH2O,Buffer B為1%TFA/ACN/ pH 2.0。純化前用Buffer A溶解;如果溶解不好,用Buffer B溶解後,然後用Buffer A稀釋;對疏水性強的多肽,有時還需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗產物,如果多肽不長(15aa以下),一般會有主峰,主峰通常為全長產物;對於20aa以上的長肽,如果沒有主峰,HPLC需搭配Mass來判定分子量,進而確定哪個峰是所要合成的多肽。
建立测定某多肽HPLC法 多肽是人体自身存在而且必需的活性物质,是人体的重要组成物质、营养物质,它广泛分布于人体各部位,特别是在大脑里,几乎对所有的细胞都有调节作用。人体缺失了多肽,免疫系统及各功能系统就可能发生紊乱,就会出现各种慢性病。多肽还具有抗菌、抗肿瘤、增强传统抗生素对耐药菌的活性、促进创伤愈合等多项生物学功能。这也就成为其在医药、食品防腐、保健品及化妆品等领域具有广阔的应用前景。 蛋白质的生理功能主要由肽来完成,有人甚至说肽是生命的统帅,对生命非常重要。所以肽及多肽的生产、合成也是非常重要的。当然测定工作也是很重要的。 某药物研究所通过药物机理成功的合成了某营养成分--某多肽,由于涉及到一些保密成分,暂时定义为“多肽X”。以下测定实验就是一是为了测定多肽,二是为了通过对某药品中多肽的测定,以便对该多肽成分制备提取提供可行性方法及理论数据。1 实验概述1.1 实验目的a.为了测定多肽。b.为了通过对某药品中多肽的测定,以便对该多肽成分制备提取提供可行性方法及理论数据。1.2 实验要求a. 梯度基线漂移不超过20mAu,分离度好。b. 定性定量分析结果准确可靠。c. 通过对某药品中多肽的测定,完善色谱条件(主要是流动相和检测波长的确定),为该多肽X的制备提取做工作。1.3 实验原理以乙腈和水为流动相,加入阴离子对试剂三氟乙酸,与多肽的质子化氨基结合,以提高多肽样品的保留值。1.4 实验环境1.4.1仪器设备:高效液相色谱仪(梯度洗脱泵,紫外检测器)手动进样器1.4.2环境:温度:24℃湿度:45%2 实验方案2.1色谱条件(参考):色谱柱:STC C18(250*4.6,5um)波长:210nm流动相A:0.1%三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液流动相B:0.1%三氟乙酸(TFA)的水溶液http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308311139_461282_2369266_3.png[font