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随着人们生活水平的不断提高,食品安全变得尤为重要。对于肉制品中动物源性的检测成为现在的一个新的领域。往往会看到刷羊肉中掺杂鸭肉、牛肉干其实用的是貂肉等新闻。目前这项检测技术并没有完全普及实验室,今天和大家一起探讨一下运用PCR技术测定动物源成分(即动物源成分鉴定)。[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09512.gif[/img]好多肉肉,不知道吃的是什么肉。[align=center][img=,400,300]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707130909_01_2362238_3.png[/img][/align][align=center][b] 一、实验室场地要求[/b][/align]PCR实验室的场地明显区分于化学检测。对于实验室要求符合《GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测实验室技术要求》,要具备样品制备区、核酸提取区、扩增区和检测区四大功能区,并且对于各个工作区域的压力有一定的要求。我公司拥有完整的PCR实验室(如图),我们的方法开发也在这里进行的。[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09502.gif[/img]请叫我摄影师!下面图片都是我拍出来的。[align=center]PCR检测室[/align][align=center][img=,690,517]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707130912_01_2362238_3.png[/img] [/align][align=center]准备室[/align][align=center][img=,690,517]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707130912_02_2362238_3.png[/img] [/align][align=center]提取室[/align][align=center][img=,690,517]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707130912_03_2362238_3.png[/img] [/align][align=center]扩增室[/align][align=center][img=,690,517]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707130912_04_2362238_3.png[/img] [/align][align=center]检测室[/align][align=center][img=,690,517]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707130912_05_2362238_3.png[/img] [/align][align=center][b]二、实验仪器设备[/b][/align]1.荧光定量PCR测定仪(博日 FQD-96A)2.普通PCR测定仪(博日 NPA-32)3.核酸测定仪(Thermo Narodrop)4.凝胶成像仪(勤翔 1850)5.粉碎机6.液氮及研磨装置7.恒温水浴锅8.[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]9.电泳[align=center][b]三、试剂和耗材[/b][/align]1.动物基因组DNA抽提试剂盒2.无水乙醇3 .10×PCR反应液4 .dNTP5 .Taq酶6.引物7 .纯狗肉(阳性对照)、其他非狗肉相近动物源,如貂(阴性对照)8 .1.5mL离心管、枪头、PCR反应管[align=center][b][b]四、实验方法[/b][/b][/align][b](1)样品DNA的提取[/b]a、将约30mg的新鲜动物组织在液氮中充分研磨成粉末,并转移至1.5mL的离心管中。b、加入200μL 缓冲液GA,震荡至沉底悬浮,加入20μL Proteinase K,溶液混匀后,56℃放置直至组织溶解,期间混合样品2~3次。c、加入200μL缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10min,溶液变清亮后,简短离心,去除管盖内壁的水珠。d、加入200μL无水乙醇,充分振荡混匀15s,简短离心,去除管盖内壁的水珠。e、将上一步所得溶液加入吸附柱CB3中,12000rpm离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中。f、向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD,12000rpm离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中。g、向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW,12000rpm离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放回收集管中。h、重复操作步骤g。i、将吸附柱CB3放回离心管中,12000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。j、将吸附柱CB3转入新的1.5mL离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200μL的洗脱缓冲液TE,室温放置2~5min,12000rpm离心2min,将溶液收集到离心管中,-20℃保存。[b](2) 定性PCR检测[/b]a、配制反应体系[table][tr][td][align=center]试剂名称[/align][/td][td][align=center]体积(μL)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]10×PCR反应缓冲液[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]dNTP[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]上游引物[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]下游引物[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Taq酶[/align][/td][td][align=center]0.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]模板[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]水[/align][/td][td][align=center]36.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]总计[/align][/td][td][align=center]50[/align][/td][/tr][/table]b、反应程序[table][tr][td][align=center]变性[/align][/td][td][align=center]扩增[/align][/td][td][align=center]循环次数[/align][/td][td][align=center]最后延伸[/align][/td][/tr][tr][td=1,3][align=center]94℃ 3min[/align][/td][td][align=center]94℃ 30S[/align][/td][td=1,3][align=center]35[/align][/td][td=1,3][align=center]72℃ 5min[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]58℃ 45S[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]72℃ 45S[/align][/td][/tr][/table]c、反应对照设置阳性对照:用纯狗肉所提的DNA作为模板阴性对照:用非狗肉,如貂肉等所提DNA作为模板空白对照:用配制反应体系的实验用水代替模板[b](3)凝胶电泳检测PCR产物[/b]a、称取1g琼脂糖,加入50mL TBE缓冲液,微波加热溶解。b、稍冷却后,加入5μL 4s Red Plus核酸染色,倒入制胶板,放置凝固。c、取5μL所提DNA和1μL 6×Loading Buffer混匀,加到点样孔中。d、100V电泳10min,然后将电压调至110V,电泳35min。e、凝胶成像观察电泳结果。[b](4) 限制性内切酶酶切及产物电泳检测[/b]如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性,进行限制性内切酶酶切反应a、 反应体系[table][tr][td][align=center]试剂名称[/align][/td][td][align=center]体积(μL)[/align][/td][/tr][tr][td][align=left]酶切缓冲液[/align][/td][td][align=left]2[/align][/td][/tr][tr][td][align=left] Hph I酶[/align][/td][td][align=left]2[/align][/td][/tr][tr][td] PCR扩增产物[/td][td]16[/td][/tr][tr][td][align=left]总计[/align][/td][td][align=left]20[/align][/td][/tr][/table]b、 反应条件37℃ 20min[b](5)结果分析与判定[/b]a、酶切后有目的基因条带,且阳性对照、阴性对照和空白对照均正确,可根据结果判定被检样品中含有狗源性成分。b、酶切后不含有目的基因条带,且阳性对照、阴性对照和空白对照均正确,可根据结果判定被检样品中不含有狗源性成分。c、如阳性对照、阴性对照、空白对照有一项不符合判定标准,则应重新试验。终于写完了,请大家多多支持!谢谢[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09506.gif[/img][b] [/b]
日前,欧盟食品安全局(EFSA)就其转基因动物源性食品和饲料的风险评估(包括动物健康和福利方面)指南草案,展开公众评议;评议截止日期为2011年9月30日。在该指南草案中,EFSA就申请转基因动物源性食品和饲料欧盟上市许可所须风险评估的具体数据要求和研究方法做出了规定。该风险评估方法是将转基因动物源性食品和饲料与常规动物源性产品进行比对;评估包括食品/饲料安全和动物健康及福利等方面内容。当前的指南草案规定的风险评估方法假定传统饲养动物源性食品和饲料具有长期使用安全史,从而将其作为转基因动物源性食品和饲料的风险评估基准。指南规定了开展风险评估对比分析所需的具体数据要求。风险评估的重要内容包括分子特征,成分分析和毒性、营养及潜在过敏性评估。草案还列明了转基因动物健康和福利对比评估的方法。该评估主要用于两个方面:一是对转基因动物自身,评估重点应放在动物身体系统的正常功能(比如抗病能力);二是对食品和饲料风险评估,因为动物的健康和福利状况被视为动物源性产品安全性的一个重要指标。草案强调了广泛开展转基因动物与传统动物特征和特性(包括生理参数)对比分析的必要性。草案还建议应在转基因动物生长的所有阶段进行动物健康和福利评估,直至其要获得授权的时点。草案建议的三阶段评估策略包括转基因动物最初生长的实验室环境,实验室外大量动物的实地试验以及在商业环境下的大量动物试验(授权前)。草案的最后还针对转基因动物和转基因动物源性食品和饲料的上市后监督(PMM)提出了建议,以便在相关产品获准上市后,发现其可能出现的与转基因相关的潜在不良影响。针对食品和饲料的安全问题,PMM是对全面上市前毒性测试计划的有力补充。针对一些特定情况,如营养成分改变的转基因食品和饲料,以及/或改变基因以实现特定健康效果的食品和饲料,均应实施PMM。针对动物健康和福利,PMM则旨在发现可能存在的发生率较低的长期不良性影响。
SB/T 10923-2012 肉及肉制品中动物源性成分的测定 实时荧光PCR法扩项报告[img=,690,514]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121354131339_2537_2166779_3.jpg!w690x514.jpg[/img][img=,690,278]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121354227259_115_2166779_3.png!w690x278.jpg[/img][img=,690,520]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121358160319_3798_2166779_3.png!w690x520.jpg[/img][img=,690,260]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121358296319_9317_2166779_3.png!w690x260.jpg[/img][img=,690,579]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121358379319_2077_2166779_3.png!w690x579.jpg[/img][img=,690,206]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121358476389_5015_2166779_3.png!w690x206.jpg[/img][img=,690,347]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121358558709_5282_2166779_3.png!w690x347.jpg[/img][img=,690,318]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121359016279_347_2166779_3.png!w690x318.jpg[/img][img=,690,373]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121359084229_628_2166779_3.png!w690x373.jpg[/img][img=,690,378]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810121359247099_4235_2166779_3.png!w690x378.jpg[/img]