【资料】HPLC系统与高效液相色谱技术

二、仪器结构
1．2487双通道紫外检测器：

图1 2487检测器外观


图2 2487的显示屏

图3 2487的控制面板





2．Waters600色谱泵


图4 600泵的控制面板

三、原 理
色谱法的分离原理是：溶于流动相（mobile phase）中的各组分经过流动相时，由于与固定相（stationary phase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在流动相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。
四、使用范围
高效液相色谱法适用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的80%。其余20%的有机化合物，包括永久性气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物，只能用气相色谱法进行分析。
五、 操作步骤
1． 600泵的操作步骤：
a. 600泵的启动
600泵接通电源后，首先运行自检程序，通过自检后，显示初始屏幕。初始屏幕显示：型号，版本号等，并显示下一步操作的提示键。
*开机顺序
检查600泵的电路，流路和氦气已按要求正确连接。
确认氦气减压表在50－90psi间。
接通电源。
通过自检后，氦气脱气操作。
按setup键，进入设置窗口
移动光标至流动相脱气区（瓶号：ABCD）
按1键和enter键，打开相应流动相瓶号的氦气开关
在此窗口中还可设置温度和压力上下限范围
移动光标至相应操作区，用数字键输入数值，按回车键确认
按direct键，进入isocratic窗口
移动光标至氦气流速sparge区
按数字键输入数值,并以enter键确认。
刚开始时通常以100ml/min, 脱气15 分钟。平衡后，可根据流动相的不同而降低氦气流速。
*抽液操作
移动光标键至组分区new composition
在A下方，键入100，enter键
其他组分（BCD）下方键入0，enter键
将抽液阀inlet manifold valve旋至draw位
用针筒抽A液10ml，将抽液阀旋至run位
重复以上操作分别抽取B，C，D液10ml。
*冲洗操作
移动光标键至组分区new composition
在A下方，键入100，enter键
其他组分（BCD）下方键入0，enter键
旋开参比阀reference valve
移动光标键至流速区flow rate
设置流速为10ml/min: 键入10，enter键
将抽液阀旋至draw位用针筒抽液10ml
将抽液阀旋至inject位，并推出针筒中的液体
将抽液阀旋至run位。此时参比阀排出的液体应连续，如不连续则重复以上抽液排液操作。
将流速减小至0.2ml/min
将参比阀关闭。

b. 600泵的实验操作
*等度实验
按direct键，进入isocratic菜单。
依次设定流路配比，氦气流速，柱温。
设定方法如下：
按光标移动键，至闪烁光标出现在所需设定位置上。
用数字键设定数值，按enter键确认。
设定流速为0.1ml/min,设定方法同前
逐渐增加流速至实验所需的流量。
待系统平衡后开始实验。
*梯度实验
设定梯度表
按program method键，进入梯度编辑窗口。
移动光标键至table #处，输入数字键(1-15)，按enter键
将光标移至梯度表第一行，依次输入流速和流量配比，分别按enter键确认
光标移至第二行，依次输入梯度时间，流速，配比及曲线号(1-11)
重复以上操作，至梯度表全部编完
按显示屏对应功能键save，并记住table #
设定事件表(option)
按program table键，进入编辑菜单
移动光标键至table #处，输入数字键(1-15)，按enter键
将光标移至事件表第一行，依次输入事件号(1-10)和开关，按enter键确认
光标移至第二行，依次输入事件时间，事件号，和开关，按enter键确认
重复以上过程至事件表完成
按save键储存。

运行梯度表
按operate methods键，进入梯度方法运行窗口
将光标移至table处，输入欲运行的表号(1-15)
按显示屏对应功能键start run，运行
c. 实验结束
对泵进行冲洗后，关闭流量，注意流速必须要逐步变化。
*冲洗顺序
如果使用有缓冲液的流动相，则停泵前一定要用HPLC级纯水清洗HPLC系统。
同时用清水清洗柱塞杆。
若停泵存放时间超过一天，则停泵前还需用水/甲醇清洗系统。
*关闭电源开关。
2. 2487检测器的操作步骤
a. 开机
检查2487的电路，流路已正确连接
如较长时间未用, 开机前用HPLC级甲醇(已经过滤和脱气)用1ml/min 流速冲洗至少15分钟
接通电源开关
LCD面板显示一系列自检过程，约7分钟
通过自检后显示吸光度主屏幕
b. 单/双波长方式的设定
当2487在Stand alone模式下运行时，可通过面板键盘选择其单/双波长检测方式
2487的预设方式是单波长方式,在主屏幕下,按λ／λλ(Shift +Autozero)键可在 单/双波长方式间切换,并被检测器记忆存储,下次开机时,2487会显示上次关机时的设置,主屏幕右侧会出现一个λ或λλ标记,分别表示检测器已处在单或双波长方式下
在主屏幕下可用A/B键切换通道,分别观看A或B通道的吸光度检测值，并可分别键入波长和灵敏度数值,以及其它参数
c. 关灯
为节省灯的使用寿命,可在2487不关机的情况下,只把灯关闭 (Waters 建议:只是在关灯时间超过4小时以上时才需要实施关灯操作,因为频繁开关灯,同样会有损灯的寿命)
按Lamp(Shift,1)键,出现一个灯控制屏幕
再按一次Lamp(Shift,1)键,即将灯关闭,显示屏上会出现灯关闭的信息和图示
d. 关机
关机前需保证流动池内无缓冲盐，用100%水冲洗，以洗去缓冲盐
再用90:10的甲醇/水，冲洗系统，并将系统保存在该流动相中
将面板右下角的电源开关扳到off, 即将2487检测器关闭。

六、注意事项
1．柱的使用和维护注意事项
①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。
④选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。
⑤避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。
⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。
⑦保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
⑧每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。
2．泵的使用和维护注意事项
为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：
① 防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、
缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。
② 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停
泵过夜或更长时间的情况下。
③ 泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。
④ 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。
⑤ 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作

谢谢楼主的分享!!

疯子哥的技术还真是全面啊，学习了。

谢谢疯子哥，你辛苦了