〓猪哥哥〓
第1楼2008/11/14
还可以发一个LC用于蛋白质和生物大分子的研究原理和概述。这个我还是空白。
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第2楼2008/11/14
常用的液相色谱纯化方法及其原理
方法 分离原理 基于
凝胶过滤(GF) 分子大小/形状 分子形态
离子交换色谱(IEX) 分子所带电荷 Asp、Glu、Lys、Arg His
等带电氨基酸
疏水作用色谱(HIC) 表面疏水性 Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、
Pro、Met、Val、Ala等疏水性氨基酸
反相色谱(RPC) 表面疏水性 Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、
Pro、Met、Val、Ala等疏水性氨基酸
金属螯合色谱(IMAC) 分子与金属形成配位键 His、Trp、Cys
亲和色谱 特异生物识别作用 抗原-抗体,酶-底物,
酶-抑制剂等
共价结合色谱 共价结合 巯基(Cys)
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第3楼2008/11/14
目前常用液相色谱纯化方法
1、凝胶过滤(gel filtration,molecular sieve chromatography 分子筛、size exclusion chromatography 大小排阻色谱,gel permeation chromatography 凝胶渗入色谱)。
根据分子大小和形状进行分离的一种方法,分子量(Stroke半径)较大的先出峰,分子量小的后出峰。最常用的经典凝胶为Sephadex G系列,此外还有Sephacryl、Sepharose、Superose、Superdex等凝胶系列。凝胶过滤法方法简单、重现性强,目前广泛应用。
凝胶过滤具有很多不同分离范围的凝胶系列供选择。
要点: 采用细长(L/D~20)的柱、选择合适的凝胶、上样体积较小、流速较慢。
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第4楼2008/11/14
常用凝胶过滤用凝胶及其基本参数
系列 名称 分离范围 颗粒大小 应用
Superdex prep grade系列 Superdex 30PG 小于10000 24~44微米 小肽
Superdex 75PG 3000~70000 24~44微米 一般蛋白
Superdex 200PG 10000~600000 24~44微米 单抗、大分子蛋白
Superose系列 Superose 6 PG 5000~5000000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸、病毒
Superose 12 PG 1000~300000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸
Sephacryl HR系列 Sephacryl S-100 1000~10000 25-75微米 肽类、小蛋白
Sephacryl S-200 5000~250000 25-75微米 一般蛋白
Sephacryl S-300 10000~1500000 25-75微米 抗体等较大蛋白
Sephacryl S-400 ~28000000 25-75微米 多糖、蛋白多糖、脂质体
Sephacryl S-500 ~60000000 25-75微米 <1078bp的DNA片断
Sephacryl S-1000 ~100000000 40-105微米 <20000bp的质粒、巨大多糖、病毒
Sepharose FF系列 Sepharose 6 FF 10000~4000000 45~165微米 质粒、病毒
Sepharose 4 FF 60000~20000000 45~165微米 病毒,rHBsAg等巨大分子
Sepharose xB(CL-xB)系列 Sepharose 2B 70000~40000000 60-200微米 大分子复合物
Sepharose 4B 60000~20000000 45-165微米 病毒等大分子
Sepharose 6B 10000~4000000 45-165微米 大分子
Sephadex LH系列 Sephadex LH20 100-4000 30-100微米 天然产物
Sephadex LH60 400-20000 40-120微米 天然产物
Sephadex系列 Sephadex G-10 小于700 40-120
Sephadex G-15 小于1500 40-120
Sephadex G-25
coarse 1000-5000 100-300 脱盐及更换缓冲液用
Sephadex G-25
medium 1000-5000 50-150
Sephadex G-25
fine 1000-5000 20-80
Sephadex G-25
superfine 1000-5000 10-40
Sephadex G-50
coarse 1500-30000 100-300 小蛋白、多肽的分离
Sephadex G-50
medium 1500-30000 50-150
Sephadex G-50
fine 1500-30000 20-80
Sephadex G-50
superfine 1500-30000 10-40
Sephadex G-75 3000-80000 40-120 一般蛋白的分离
Sephadex G-75
superfine 3000-70000 10-40
Sephadex G-100 4000-150000 40-120 较大蛋白的分离
Sephadex G-100
superfine 4000-100000 10-40
Sephadex G-150 5000-300000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G-150
superfine 5000-150000 10-40
Sephadex G-200 5000-600000 40-120 大蛋白的分离
Sephadex G-200
superfine 5000-250000 10-40
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第5楼2008/11/14
2、离子交换色谱(ion exchange chromatography)
蛋白质、多肽均属于两性电解质,在缓冲液pH小于其等电点时,带净正电荷,而在缓冲液pH大于其等电点时,带净负电荷。阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团,阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上,再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行洗脱
对于等电点小于5.0的酸性蛋白质,推荐使用阴离子交换,对于等电点大于7.0的碱性蛋白质,推荐使用阳离子交换。
两种模式:一种使目的蛋白结合凝胶,通过梯度洗脱;一种使目的蛋白不结合凝胶,而大部分杂质结合凝胶,则穿过液中含有目的蛋白。
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第7楼2008/11/14
4、亲和色谱
利用蛋白质、多肽与某些配基的特异性相互作用而进行分离。例如:酶-底物,酶-抑制剂,糖蛋白-凝集素,抗原-抗体等。近来发展了金属螯合亲和色谱,用于纯化表面含色氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋白质以及(His)6-tagged重组蛋白。
亲和色谱分为特异性亲和色谱和组别亲和色谱两类。肝素、凝集素、染料、金属螯合亲和色谱均为组别亲和色谱(同一配基可以结合许多种蛋白质)。
5、反相色谱
常用于蛋白质、多肽的HPLC分析,以及多肽的精细制备分离,分辨率极高,可以分离两种仅相差一个氨基酸的多肽。如血管紧张素(angiotensin)的几个亚型通过反相色谱可以很好地分离。
同一个样品在同一Source 30 RPC柱上进行分离,由于色谱条件进行了改变,色谱图截然不同,说明反相色谱具有高度的选择性。