一道黑
第1楼2008/12/01
9 测定步骤
9.1 水解
取5 mL胆汁,15 mL磷酸缓冲液(pH7)和50 mL葡糖苷酶于20 mL试剂瓶中, 37℃培养,过夜。
9.2 Extrelut净化
按照使用说明,制备Extrelut柱。该柱放于Quick-fit expansion adaptor中,然后接在50 mL (MF-24) Quick-fit 管端上。加入胆汁缓冲液混合液,停留30分钟,然后用2 35 ml乙酸乙酯洗脱。氮气流下浓缩乙酸乙酯至约5 mL,然后移入10 mL锥形离心管中。氮气流下吹干。加入2 mL二氯甲烷/正己烷(40:60,v/v)溶解残余物。
9.3 Bond-Elut净化
CN键合Bond-Elut柱依次用2 2 ml甲醇和2 2 mL石油醚洗涤。在柱干涸前加入提取液,用2 mL二氯甲烷/正己烷(70:30,v/v)洗涤。NH2键合柱依次用甲醇洗涤二次和2 2 mL石油醚洗涤。用乙酸乙脂饱和NH2柱。CN键合柱接在NH2键柱之上,然后用3 mL乙酸乙酯洗脱。弃去CN键合柱。用2 mL 2% (v/v)甲醇/二氯甲烷洗涤。用3 mL 33% (v/v)甲醇/二氯甲烷洗脱NH2键合柱,洗脱液收集于带盖的离心管中。
9.4 衍生化
吹干甲醇/二氯甲烷提取液,用1 ml 庚烷溶解,加入100 mL HFBA(新开安瓶),拧紧瓶盖,在Techni Dri-block中,80oC下,3 min后,振摇,保证两相充分混合。20分钟后,移去试管,冷却。
玉米赤霉醇标准浓度 = 1 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 500 ng, 1 g, 10 g/mL.
9.5 柱后衍生柱净化
为了改善色谱系统,加入5 mL磷酸缓冲溶液(pH 6)净化衍生提取物。充分振摇30 s,分层(如有必要,在2000 rpm离心5 min)。吸去上层正己烷层,用移液枪设定0.7 mL, 立即拧紧进样瓶盖子。
9.6 GC-MS 分析
9.6.1 GC参数
色谱柱:J & W石英毛细管柱,SE-54,15 m 0.25 mm
进样:0.5 L手动进样
温度:(1) 接口:230oC; (2) 进样器:220oC
标液:
-------------------------------------------------------
初始浓度 最终浓度 速率 时间 总时间
(℃) (℃) (℃/min) (min) (min)
-------------------------------------------------------
55 55 1.0 1.0
55 240 20 9.2 10.2
240 240 10.0 20.2
-------------------------------------------------------
载气:氦
流速 = 1 cm3/min
进样压力 = 10 psi
GC阀:毛细管 关闭:0.00 打开:0.7
分流 关闭:0.00 打开:20.2
9.6.2 按下面设定MS参数。用适当校正剂(例如PFTBA调整剂)进行校正。
离子化源模式:化学离子化(CI)
温度:130℃
压力:50 Torr
多支管:
温度:90( 5)℃
电子倍增器:1.2 kV
电子能量:70 eV
反应气:氨
其它参数通过校正仪器达到最佳化,具体操作参考仪器说明书。
9.6.3 化学离子化模式中,用氨作为反应气,在m/z = 50 - 700 之间扫描。
(a) 空白正己烷
(b) 100 L溶液中含10 g玉米赤霉醇标准品,采集1000扫描。
9.6.4 对玉米赤霉醇标准品聚焦。在谱图中找出离子279,296,519和526的精确质量。
9.6.5 用这些质量设定或调整多离子检测(MID)扫描目录,建立扫描目录。
9.6.6 注入正己烷, 确定没有载入玉米赤霉醇。
9.6.7 用建立的扫描目录,对标准品和样品进行GC-MS分析,可采取:
(a) 首先分析100 g标准品,确保MID设定准确,随后注入正己烷。
(b) 以浓度递增的序列分析标准品
(c) 在组分流出色谱柱进入离子源之前,打开灯丝,100扫描后关闭。
(d) 每次进样之间,注入正己烷。
10 结果计算
如果GC-MS数据符合下面的标准,确定样品中有玉米赤霉醇
1.在GC中,出峰时间与标准品一致。
2.扣除背景后,所选择的离子在质谱图中都出现。
3.所选择的离子比与标准品相一致。
如果样品中有玉米赤霉醇,并符合上面标准,定量计算按下面二种方法选择其一:
1.用数据系统计算峰面积,建立定量表,用相应标准品或用标准品系列建立定量数据库。以样品数据对照该数据库,得出定量报告。本法为首选方法。
2.测定样品和相关标准品的峰面积。玉米赤霉醇在待测总样品中浓度由下式计算:
样品峰高
------------ 标准品浓度
标准峰高
检测限:2 g/L 胆汁。
用于trenbolone(参考trenbolone 标准操作程序)的TMS衍生同样适用于玉米赤霉醇。这样质谱仪采用EI模式,离子聚焦于307,335,433,538。
11 特殊事例
12 方法注意点
13 质量控制,标准品和参考物质
玉米赤霉醇参考物质制备参阅 Measuremt and Testing Programse of DG12
14 检测报告
15 缩略语(略)
16 检验流程图
酶解 酯洗脱
胆汁-------→ extrelut柱---------→ 吹干--→ CH2Cl2/MeOH----→ CN-Bond-Elut柱
洗脱 洗脱
-------→ NH2-Bond-Elut柱 -------→ CH2Cl2/MeOH --→ HFBA衍生 -----→ 用磷酸
缓冲液净化 -----→ GC-MS ---------→ 计算结果。