【分享】欧盟兽药检测方法（之二十八）

7 仪器设备
7.1 Hamilton 注射器，5μl，50μl，1000μl 7.2 自动吸管，20μl，200μl，1000μl，5000μl 7.3 涡流旋转均质器 7.4 超声波浴槽 7.5 加热块，带有氮气蒸发装置 7.6 加热块，(Pierce-18780)用于衍生化 7.7 加热块，带有氮气蒸发装置，用于6mL和12mL溶血管(haemolysis tube)
7.8 塑料瓶，带密封盖，容积30mL
7.9 离心机
7.10 水解炉
7.11 衍生化小瓶：适用于气相色谱手动或自动进样
7.12 真空抽气装置：用于SPE柱(Vac Elut,Prolabo-07485001)
7.13 玻璃溶血管：6mL和12 mL，具一次性使用塞子。
7.14 pH试纸
7.15 巴斯德吸管
7.16 Parafilm
7.17 Mega Bondelut C18柱(Varian-AI 122560-15)
在10mL容器中含2g接枝树脂。
调节：先用10mL甲醇，再用10mL超纯水洗柱，勿使柱干。
7.18 G60硅胶柱：采用玻璃柱(15cm×10mm i.d)装有10mL储液器和手动流量调节器(L.N.R)
制备：将硅胶置于盛有洗脱液2(6.3.3.2)三氯乙烷/醋酸乙酯(80/20)的烧杯中，并充分搅拌。将其倒入柱中至8cm高度。用洗脱液2(6.3.3.2)洗柱，并将硅胶填实。再用10mL洗脱液2(6.3.3.2)洗柱，勿使柱干。此柱已可应用。
7.19 气相色谱/质谱
7.19.1 气相色谱(HP-5890型)
进样：无分流方式，1分钟打开分流阀
进样体积：2ul
柱子：弹性石英毛细管柱，30m×0.25mm id,SE-30膜厚25μm。
温度；进样口：280℃，转输线：280℃；
柱：120℃(1min) 15℃/min 250℃ 5℃/min 300℃(4min)再回到120℃  载气：高纯氦
流量：1 mL/min
柱前压力：5psi
7.19.2质谱
EI方式：70 eV
选定扫描时间，使每秒循环数接近2。
源温度，190℃
电子倍增器、离子聚焦和入口透镜值均通过自动调谐计算。
8 样品和取样程序
此节是根据6.3.1节和国际标准化组织(ISO)有关文件(ISO 78/2-1982)内容起 草的，如下事项源于欧盟有关文件2052/Vl/84-EN的附录II。
8.1样品性质：按照64/433/EEC指令的定义，样品应达到使肉中残留检测能得以进行。若无此类样品，可用体液（尿）或粪便替代。
8.2样品量：样品量必须足以完成本方法测定，并足以进行所需要的重复分析。
8.3样品的抽取和包装方法必须适合能在实验室正确识别。
8.4包装、存放及传递方法必须保持样品的完整性，不能对检测结果产生不利的影响。用于测定人工合成性激素的样品，必须在低于-18℃温度下保存和传递。
9 测定步骤
9.1 将尿样解冻。 9.2 将大于20mL的尿样，在3000rpm下离心，转移20mL上清液至塑料容器中(7.8)。
9.3加2mL醋酸盐缓冲液(6.3.1)，用冰醋酸(6.2.8)调节pH至5.2±0.2。加200ng 氚标记—甲基睾酮。
9.4 将两个空白尿液按9.1—9.3步进行处理，其中一个空白尿液加入人工合成性激素标准。 9.5 所有尿液均加100ul Helix Pomatia(6.2.4)，置52℃保温箱中15h。 9.6 固相萃取(SPE)净化：
9.6.1 将水解的尿液转移至已调节好的Mega Bond Elut柱中(7.18)。令柱干30 sec 。在真空抽气下，用10mL超纯水洗柱直至排出。再用10mL正己烷洗柱。
9.6.2 用5mL洗脱液1(6.3.3.1)将所有甾族化合物洗脱至12mL试管中(7.14)。
9.7 加2mL碳酸盐溶液(6.3.2)至洗脱液中，然后涡流振动10 Sec。在10，000 rpm下离心1 min。转移上层有机相至干净试管中。
9.8加2mL碳酸盐溶液(6.3.2)至有机相中，涡流振动10sec。在10,000rpm下离心1min。转移上层有机相至干净试管中。
9.9在50°C加热块上，用氮气流将有机相蒸发至近干。避免残留物热分解。
9.10在硅胶60柱上进一步净化。
9.10.1加1mL洗脱液2(6.3.3.2)至残渣中，涡流振动，然后将其置于超声波浴槽中几秒钟。
9.10.2用巴斯德吸管将溶液转移至准备好的硅胶60柱床上(7.19)，令其排至柱中。用0.5mL洗脱液2(6.3.3.2)按9.10.1步骤重复一次。
9.10.3用4mL洗脱液2(6.3.3.2)洗柱。
9.10.4用13mL洗脱液2(6.3.3.2)洗脱雌激素类物质，收集其作为收集液Ⅰ。加100ng二氯苯作外标。
9.10.5用12mL洗脱液3(6.3.3.3)洗脱雄激素和孕激素，并收集其作为收集液Ⅱ。加100ng炔诺孕酮作外标。
9.11在50°C下，用氮气流吹收集液Ⅰ和收集液Ⅱ使浓缩至约500μl。
9.12旋涡振动试管以使管壁润湿，然后，在1000 rpm下离心1min，以使液体沉至管底。
9.13将试管中内容物转移至小反应瓶中(7.12)，在50°C加热块上将其蒸发至近干。避免残留物热分解。
9.14衍生化(必需在无水条件下进行衍生化)
9.14.1加20μL衍生溶液(6.3.4)，立即盖紧小瓶，旋涡振动并超声波处理，在60℃下加热30min。
9.14.2该衍生物可用于进样，于密封瓶中在4℃下最多贮存至48h。
〔注：可用N-甲基-N-(叔丁基甲基硅烷〕三氟乙酰胺：MTBSTTA(6.2.17)将收集液Ⅰ中二苯乙烯类药物进行衍生化，以增加其保留时间和离子质量。从而提高它们的专一性。〕9.15应用7.20所描述的条件，进样2μl至气相色谱／质谱仪。
10结果解释
10.1人工合成性激素的近似保留时间如表1所示。这些保留值将有所变化，而且，应对内标保留值的关系进行系统地研究。
10.2用于监测的选择离子应事先确定。按照规则它们应是：高质量；高强度；消除柱流失及本底离子干扰。
10.3如果有2或3个离子其信噪比大于3，则此样品可疑为“阳性”。
10.4气相色谱参数必需满足EEC93／256(见5节)规定。
10.5空白尿样必需清除所有被认为是人工合成性激素的证明离子。
10.6外标和内标离子必须出现。

11，12略

13 质量控制 见手册第8节有关人工合成性激素标准物质详细叙述。
14 略
15 缩略语（略）
在第12节的附录Ⅰ给出全部缩写词表。 16 检验流程图

尿样 水解 C18柱固相萃取 碳酸盐洗

收集液Ⅰ TMS—衍生化 收集液Ⅱ 硅胶60柱


气相色谱／质谱 解释结果