【分享】欧盟兽药检测方法（之二十九）

7. 仪器设备
所涉及的仪器设备及生产公司仅供参考，相当型号的产品也可适用。

7.1. 玻璃巴斯德Pasteur毛细吸管
7.2. 自动吸管
7.3. 具玻璃电极PH计
7.4. 可调温电子水浴锅
7.5. 涡流旋转均质器
7.6. 小过滤漏斗
7.7. 衍生化玻璃小瓶(Chromacol 250(A)):具螺旋塞(Chromacol 85C)和隔垫(Chromacol 8-ST15)。或用具玻塞尖底烧瓶或锥形试管代替。用前，将小瓶用二甲基二氯硅烷(6.14)进行硅烷化。
7.8. 加热器(Pierce no.18790)， 具吹氮气装置，设定60℃，用于加热衍生化小瓶。
7.9. 固相萃取(SPE)柱
7.9.1 C18柱，(一次性的6mL，Baker，USA)
用2×5mL甲醇和2×5mL水洗涤柱，使其达到所要求的状态。
7.9.2 氨基柱(一次性3mL，Baker，USA)用3×3mL醋酸乙酯洗涤柱，使其达到所要求的状态。
7.10. 高效液相色谱(HPLC)装置
7.10.1. HPLC系统包括：泵(Waters，6000A);自动进样器(Waters Wisp 710B);流出物收集器(2212 Helirac，Pharmacia);紫外检测器(Pye Unicam，PU 4020)设定在280nm。
7.10.2. 柱子:LiChospher RP18，125mm×4mm(iD)(Merk)，通过30-50μm反相予薄膜保护柱(75mm×2.1mmid)(Chrompack，cat.no.2860Middelburg，NL)加以保护。
7.10.3. 流动相:甲醇：水(65:35，V/V)流速为1mL/min。
7.10.4. 先以25ng炔雌二醇进行实验，以确定收集炔雌二醇的时间窗口(Time-window)。
7.11. 气相色谱/质谱(GC/MS)装置
7.11.1. 毛细管气相色谱仪:配备可在290℃下操作的全玻璃进样口(HP5890)。
7.11.2. 气相色谱自动进样器，非必需的。
7.11.3. 质谱仪:低分辩，质量范围最少为600amμ。该仪器必须可以应用多离子检测(MID)方式。也可以是专用的质量检测器(HP5970)和离子阱检测器。
7.11.4. 工作站(HP59970)
7.11.5. 打印机
7.11.6. 气相色谱柱
7.11.7 载气:氦
7.11.8. GC/MS用石英毛细管连接 ，可加热至290℃。

8.样品和抽样程序
注意事项见6.3.1.节和国际标准化组织(ISO)有关文件(ISO 78/2-1982)内容起草的，如下注释源于(2052/VI/84-EN)的附录。
8.1. 样品性质:尿样应达到使残留检测能得以进行。
8.2. 样品量:样品量必须足以完成本方法测定，并足以进行所需要的重复 分析。
8.3. 尿样收集后必须冷却，分析前应在≤-20℃下贮存。

9. 步骤
9.1. 用醋酸缓冲溶液(6.16)将10ml尿样调节至PH4.6。
9.2 将尿样置于C18柱，(7.9.1)，用2×5ml水洗涤，然后用1ml 甲醇洗脱。
9.3. 在40℃下用氮气流将甲醇蒸发至干。
9.4 用100ml甲醇溶解残渣，加5ml 0.2M醋酸缓冲液(6.17)，再加50ul 螺旋形 Pomatia汁。
9.5. 将样品在37℃下保持16h。
9.6 冷却至室温后，将样品加至经过重处理并达到要求的C18柱 中。氨基柱(7.9.2)则连接在C18柱之下。
9.7. 用2×1ml醋酸乙酯将炔雌二醇从两柱中洗脱。
9.8. 在40℃下用氮气流将醋酸乙酯蒸发至干。
9.9. 残渣溶于100ul甲醇中，将其50ul注入HPLC系统。收集 4-7min之间所甲醇-水流出液(3ml)，在氮气流下蒸发至干。
9.10. 用100ul衍生化试剂(6.18)溶解残渣，然后，在60℃下加 热1h。蒸除过量的试剂后，将最终残渣溶于50ul正己烷中，注入2ul至GC/MS系统。
9.11. 应用如下条件进行GC/MS分析
9.11.1. 气相色谱系统
气相色谱仪:毛细管气相色谱仪(HP5890)
柱子:HP Ultra-2(5%苯基甲基硅酮)石英毛细柱，
25m×0.2mmID，膜厚0.33mm。
进样:2ul，全玻璃.moving needle 290℃
载气:氦，0.47ml/min
温度程序:200℃-280℃(5℃/min)280℃(10min)
传输线温度:290℃
在上述条件下，炔雌二醇衍生化产物的保留时间，以甲烷单位
值表示为28.43。
9.4.2. 质谱条件
质谱在SIM方式下运行，应用的锁定时间(dweel time)为100 mSec。炔雌二醇衍生化产物的选择离子为440，425，300和285。

10. 结果计算
在正确的保留时间，当所有离子同时出现，并用炔雌二醇衍生化产物的标准品，对其保留行为进行 了核对，则表明样品为阳性。
所有出现离子，其信号比噪音大三倍的前题下，m/z 440离子的检出限为0.7ug/L(Daeseliere et al ，1991)。
在协同实验中未发现阴性结果(见Daeseliere et al，1991)。

11，12，13，14 略

15．缩写词表

见在附录I，手册第12节缩写词。

16. 检验流程图

尿 C18 固相萃取 水解 C18和氨基柱固相萃取


结果计算 GC-MS diTMS衍生化 HPLC