一道黑
第1楼2008/12/02
8． 样品及其取样步骤
N. B. 留意6.3.1节和国际标准化组织文件78/2-1982（E）以及由文件2052/Ⅵ/84-EN的附件Ⅱ导出的下列通则。
8.1 保证样品的天然性；即必须符合导则64/433/EEC中定义的内容，因此能够进行肉样中残留物的测定。排出的生物流体或粪便可以指定为做测定用的样品。
8.2 样品量；样品量要大到足以完成参考方法以及重复测定的要求。本方法测定β-激动素作一次测定时所要求的样品量为：
肝3g； 尿10mL； 动物饲料10g
8.3 样品采集和包装的方法，必须使实验室易于鉴别和使用。
8.4 样品的包装、贮存和运输的方法，必须保证样品的完整性，不能损害测试的结果。
做 -激动素分析的样品，必须在低于-18℃的温度下贮存和输送，饲料样品可以在+4℃的温度下输送。
9． 分析步骤
有些实验步骤使用c.q. sublitizin消化方法做样品前处理，而另一些实验步骤使用超声波提取获得肝样的提取物。根据RIVM的研究，两种前处理方法处理动物所获得的试样，被分析的结果没有表现出明显的差别。超声波方法比较简单，干扰化合物比较少，应该优先采用。
9.1 提取步骤
9.1.1 动物饲料
准确称取10.0g动物饲料于玻璃烧瓶中，加入50.0mL水。将烧瓶放入超声波水浴中提取30分钟。接下来振摇或涡流烧瓶约10秒钟，然后将烧瓶离心10分钟（1800g），从中移取19mL放入一个清洁的烧瓶中，用浓度为1 mol/L的NaOH溶液调节pH值到9.8±0.2，然后加水到体积为20mL。
9.1.2 肝
准确称取10.0g肝于一个20mL的玻璃烧瓶中，加入15mL浓度为0.01mol/L的盐酸，将烧瓶放入超声波水浴中提取15分钟。接下来振摇或涡流烧瓶约10秒钟，然后将烧瓶离心10分钟（1800g），然后滗出上清液于一个清洁的烧瓶中。用浓度为1 mol/L的NaOH溶液调节pH值到5.2±0.2，然后加水到体积为20mL。
9．1．3 尿
准确移取10.0mL尿液于一个20mL的玻璃烧瓶中，用浓度为1 mol/L的NaOH溶液调节pH值到5.2±0.2，然后加水到体积为20mL。
9．2 加酶水解
上述尿样及肝的初始提取样液被加酶水解，即往水溶液样品中加入0.1mL的Helix Pomatia（6.1.22），然后全部样品于37℃被孵化过夜。将孵化后的样品冷却到室温后，调节pH值到9.2±0.2，之后样品的体积用水调节到20mL。
9．3 Extrelut提取
经上述步骤处理的各样液（均为20mL），放入一台Extrelut提取离心机中。离心平衡15分钟后，用60mL乙酸乙酯提取水溶液，之后将提取液放入旋转蒸发器上于50℃蒸发。
9． 4 样品净化；免疫亲合力色谱
首先用至少10mL的水洗涤免疫亲合力色谱柱（IAC柱），然后用0.1mL的乙醇溶解旋转蒸发残渣，再加入50mL水并将烧瓶放入超声波水浴中至少1分钟，使残渣得到充分溶解。该水溶液被加入IAC柱，并以2mL/min的流量流过IAC柱。然后用5mL免疫亲合力色谱缓冲液（IAC缓冲液）洗出β-激动剂，再用5mL水洗涤色谱柱。合并洗出液，然后放在50℃的水浴上通冷的氮气流蒸发至干。免疫亲合力色谱柱（IAC柱）依次用5mL IAC缓冲液，25mL水和25mL PBS进行洗涤，可以使柱子得到再生。
9．5 免疫亲合力色谱洗脱物（IAC洗脱物）的脱盐处理
上述蒸发得到的干残渣用0.5mL的乙醇再次制成悬浮液，然后在4℃离心（1800g）5分钟，上清夜被转移至衍生反应玻璃小瓶中，用加热块在50℃加热通冷氮气流的条件下，使乙醇蒸发干。
9． 6 衍生化反应
上一步的蒸发残渣用0.1mL衍生化试剂溶解（6.1.21），混合物于60℃被孵化1小时（7.12），然后蒸发至干，干衍生残渣用0.025mL甲苯溶解（6.15），然后甲苯溶液转移至另一个衍生反应玻璃小瓶中（7.10），准备接受GC-MSD分析和确证实验（10.1）。
GC-MSD测试条件的设置：
进样体积： 2μL
进样温度： 260℃
进样方式： 不分流进样
初试温度： 70℃
升温梯度： 25℃/min
第一恒温点： 200℃（6 minutes）
升温梯度： 25℃/min
第二恒温点： 300℃（2 minutes）
离子监控（屏蔽）： m/z=86（叔丁基-β-激动剂）
m/z=72（异丙基-β-激动剂）
10.0 结果计算
结果计算所使用的步骤（定量化），与用内标法或外标法有关。用同位素标记的标准物质获得的校正曲线，是一条直线，它用标准物质的离子强度对内标物质的离子强度的比率作为因变量，标物质的浓度作为自变量，进行最小二乘法拟合运算而获得。用这些步骤产生的线性校正曲线，离原点的截距非常小。其它β-激动剂的定量化线性程度不是很好，然而它们在肌肉内和肝中的回收率与克喘素的回收率几乎是相等的。回收率有明显差别的唯一的化合物是舒喘灵，然而为这一化合物而使用的内标物是有效的（参看validation一节）
为了证实至少有4种离子的响应值可以同时测定出来，就有必要对标准物和未知化合物都进行计算。
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10.1 确证实验
确证新增加的离子（碎片）的目的，是为了监测它们，β-激动剂的碎片以列表的方式表示在下面。它们是按照离子强度的次序（A到F）进行表示的。
N M.W M.WD. [A] [C] [D] [E] [F]
特普他林
3 225 441 86 356 336 426 370 280
salbutamol
3 239 455 86 369 350 440 384 294
克喘素
1 276 348 86 262 243 333 277 187
cimaterol
1 219 291 72 219 186 276 234
2 219 363 72 291 258 348
mabuterol
1 310 382 86 296 277 367 311 221
式中N=TMS-基团的数目；M.W.=纯化合物的分子量；M.WD=衍生反应后的分子量
根据欧共体标准（EC-criteria）的要求， 至少有4种离子要进行监控。每一种离子的响应值，其最大值应该达到至少超过平均噪音的 3倍标准偏差（ 3D）的要求。如果达到了这一标准，全部被监控的离子就可以按照3种不同的比率来进行计算。对标准分析物来说，在相应的浓度范围内，更适合以相同的比率来进行计算。对鉴定为阳性反应的未知样品，应该要求它们的响应值，全部落在标准物响应平均值的 10 的范围内。
注意：由于MS-设备经常发生波动，因此无法保证严格执行此标准。鉴于此，可以用一种考虑了实验波动性的标准来替代此标准。替代标准中未知样品的响应值比率，应该在相应标准物响应值比率 3倍标准偏差范围内。
10.1.1 -激动剂的碎片图（参看下图 1）
10.2 确认
过去所承担的许多研究，都是为了确认实验步骤的。这些研究实验的大多数都是在实验室范围内适用（即在实验室内具有重复性和再现性）。欧共体在RIVM.的实验工作机构，在1191年4月22日到26日几天之间，除了确认实验方法以外，还负责组织和论证有关动物饲料方面的合作研究。
10.2.1 免疫亲合力色谱（IAC）实验阶段的分析回收率
每一批新制备的免疫亲合力色谱（IAC）实验材料，是否能适用于实验，必须要对它保留有关组分的容量进行测试来决定。下面是几个典型测试实验的结果（所用测试化合物的量为200 ng）：
化合物名称 IAC阶段的 回收率 ％
克喘素 95
mabuterol 111
salbutamol 103
cimaterol 96
图 1
10.2.2 （原稿没有这一节，译者注）
10.2.3 整个实验的回收率
在论证免疫亲合力色谱（IAC）实验材料的时候，必须对添加到空白尿样中的各个被侧组分，进行回收率的测定实验来确认。只有在确认实验完成之后，才允许添加内标物来对衍生反应及以后的GC-MS测定作校正分析。
化合物名称 IAC阶段的回收率
％
（平均值 标准偏差，N=2）
克喘素 102 8
mabuterol 115 4
salbutamol 56 5
cimaterol 100 5
10.2.4 重复性和再现性
重复性和实验室内的再现性，是用克喘素和salbutamol做分析实验确定的，样品来自动物的尿和肝（小牛的尿和猪的肝）。样品按三种不同的场合来进行，每一场合都做双分样品。
肝中的salbutamol
单次测定值 实验中的波动性 实验间的波动性
g/kg
3.6 3.3 =0.016 =0.065
3.4 3.3 S=0.13 S=0.25
3.7 3.7 RSD=3.7 RSD=3.7
肝中的克喘素
单次测定值 实验中的波动性 实验间的波动性
g/kg
13.8 11.2 =1.31 =2.63
12.9 12.6 S=1.14 S=1.62
15.1 14.1 RSD=8.5 RSD=12.1
尿中的克喘素
单次测定值 实验中的波动性 实验间的波动性
g/kg
4.4 4.3 =0.035 =0.122
4.2 4.6 S=0.19 S=0.35
4.7 4.9 RSD=4.2 RSD=7.8
尿中的salbutamol
单次测定值 实验中的波动性 实验间的波动性
g/kg
2.0 2.0 =0.007 =0.020
1.8 2.0 S=0.08 S=0.14
2.1 2.1 RSD=4.0 RSD=7.0
10.2.5 灵敏度
灵敏度取决于是否使用了屏蔽手段，但屏蔽只能对最丰的2种离子（m/z=86或72）进行监测。但对于4种离子都必须进行监测的确认实验而言，也要使用屏蔽手段。不过后者的灵敏度会降低，将降到4种离子的最低检测线。
11 特殊情况
特殊情况的实验步骤中，包含了一步对 -激动剂进行非共轭化处理的特殊操作，此时 -激动剂也许是以葡糖苷酸或葡糖苷酸的磷酸酯的形式而存在的。对克喘素来说，它的全部数据都能够导致不会生成共轭物的结论。对salbutamol来说，它以磷酸酯的形式存在这一点，已经叙述过了。在RIVM的研究还表明，在牛的体内，95％以上的salbutamol是以共轭的形式存在的。所以延长孵化的时间以及增大相关生化酶的量是有必要的。基于这些情况，就可以得出这样一点，即在日常制备多残留样品时，必须执行一种非共轭化处理的特殊操作。而对于克喘素这一特定分析来说，其中的水解步骤是可以省略的。对其它的 -激动素而言，目前还没有可以采用的数据。
12 实验操作步骤的注意事项
选择什麽样的实验操作步骤，应该取决于使用什麽样的实验试剂、什麽样的参考化合物和什麽样的仪器设备。
13 质量控制、标准参考物质和抗体
关键实验试剂和标准物质的来源情况，在第8节中已进行了叙述。在开会地点RIVM的实验室内，克喘素标样的制备，是将其掺入到牛肝中制成含量为1 g/kg或2 g/kg的，均质的，被冻干的批量样品。使用这些样品做的实验，在添加水平为1 g/kg时，各实验之间的最大偏差是13 ，在添加水平为2 g/kg时，各实验之间的最大偏差是8.6 ，然而它们与目标值之间的平均偏差落在85-100 范围。
13.1 免疫亲合力色谱（IAC）
以下的实验指示，是实验材料供应商推荐的与样品贮存有关的操作步骤。
13.2 免疫亲合力色谱（IAC）柱及其凝胶颗粒的来源
来自于商品提供者--
（以下为供应商的名称及其公司的名称，略，译者注）
13.3 含重氢原子的示踪标准物质
含重氢原子的示踪标准物质被保存在RIKILT．
14 实验报告
实验报告要给出对样品鉴别必须遵守的指示，使用的方法，鉴别结果及其表述用的表格，实验过程中观察到的特别点，以及使用了在方法中没有指定的但对实验结果可能会产生影响的任何操作，或者自认为是可以选择的但对实验结果可能会产生影响的任何操作。
15 缩略语表
一分最重要的缩略语表给出在附件1的第12节中。
16 流程图
仪器信息网“仪友会”招募令
科学仪器品牌联合“仪器心得”征文活动
【生活中的仪器检测】有奖征文
LC-MS实验瓶颈的突破与优化
