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延长色谱柱使用寿命的方法
色谱柱的使用寿命，除了与所分析的样品和流动相及使用频率有关系外，最主要的是与日常的委会密切相关。为延长色谱柱的使用寿命，维护您的利益，请仔细阅读此部分。
色谱柱的使用寿命主要是分局柱效和柱压两个指标来衡量，如果一支色谱柱柱效太低或柱压太高，通常被认为该色谱柱已经结束。因此，延长色谱柱使用寿命的关键是，消除引起柱效下降和柱压升高的因素。以下是色谱柱的日常维护方法：
一、流动相的PH应在使用的范围内
Welch公司的色谱柱除反相氰基柱PH1.5-9.0外，其反相色谱柱的PH范围均为1.5-10，由于填料中存在Si-C和Si-O键，流动相超过其PH范围将会导致硅胶基质流失和键合相碳链断裂，使柱效下降，使用寿命变短。由于流动相的PH 控制不当而对色谱柱造成的损害，通常很难是色谱柱恢复，因此必须认真对待，严格控制流动相的PH值。
二、去除样品和流动相中的固体颗粒
样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板，筛板被堵住不仅会引起柱压的升高，而且也会引起柱效下降，因为筛板的堵塞会引起液流不均，导致色谱峰型拖尾、变宽，从而使柱效下降。因此，建议使用超纯水和色谱纯试剂，在分析样品前对样品进行针筒过滤，流动相过0.45μm滤膜。
三、使用保护柱或在线过滤器
样品和流动相经过滤后并不能完全消除固体颗粒物质，因为泵的磨损、密封圈和管路的老化也会产生固体颗粒物质，这些固体颗粒被流动相带入色谱柱，堵塞筛板，导致柱压升高、柱效下降。保护柱和在线过滤器上都有筛板，其孔径与色谱柱孔径相同，因此可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱，有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大 比例，因此，除对样品和流动相进行过滤外，建议您在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器。
如果去人色谱柱柱压升高是由于进样端筛板被堵引起的，科选择一下方式进行补救：
1、先在色谱柱前加上保护柱或在线过滤器，然后用甲醇、水=20/80ml/min反向冲色谱柱180min。
2、先在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器，然后反向使用。
四、正确使用缓冲盐
缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂，因此缓冲盐使用不当会使其析出，堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙，使填料板结，柱压上升；同时阻碍了基质上键合的碳链自由舒展，使色谱柱的保留能力下降，柱效降低。缓冲盐析出后，去除非常困难，因此，正确的使用缓冲盐对延长色谱柱使用寿命非常重要。
正确使用缓冲盐的目的是防止缓冲盐析出，因此正确使用缓冲盐的方法可归结为一句话：使用前要过滤，使用后要冲洗。具体方法如下：
1、等度条件：使用缓冲盐前和使用后需用过渡流动相以1.0ml/min流速冲洗60min；使用后去除缓冲盐的另一个方法是用过渡流动相以0.2ml/min流速冲洗色谱柱过夜。
2、梯度条件：用含有缓冲盐的流动相跑梯度之前，用与初始流动相组成相同的过渡流动相以1.0ml/min流速冲洗60min，再用该过渡流动相以1.0ml/min冲洗色谱柱120min。含缓冲盐流动相的梯度设定应尽量平缓，以避免梯度过程中缓冲盐析出。
注意：过渡流动相是指有机相和水相的组成与分析流动相相同，区别只是过渡流动相不含缓冲盐。
3、缓冲盐析出的补救方法：
1）方案1：用甲醇/20/80以1.0ml/min流速35摄氏度条件下反向冲洗色谱柱120min
2）方案2：用甲醇/水=20/80以0.2ml/min流速反向冲洗色谱柱过夜。
五、防止强保留物质在色谱柱上存留
强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，对样品中的化合物产生额外的保留行为，不仅引起峰型变宽、拖尾，使柱效下降，同时也会引起保留时间的变化，累积到一定程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应，需要一定的时间才会体现出来，但对许多药品特别是复杂样品而言，很难判断其是否是含有强保留物质，因此要防止强保留物质的累积，需要在每天的日常维护中用纯甲醇或乙氰清洗色谱柱。
清洗方法：
1、未使用缓冲盐：每天分析完成后，先用上述方法除去缓冲盐，然后再用甲醇或乙氰反向冲洗色谱柱60min。
2、使用过缓冲盐：分析完成后，先用上述方法除去缓冲盐，然后在用纯甲醇或乙氰反向冲洗色谱柱60min
3、补救方法：
水——乙氰——氯仿（或异丙醇）——乙氰——水
每一步以1.0ml/min流速反向冲洗色谱柱60min。

氘灯使用需知
氘灯的使用寿命有多长？

氘灯主要产生190~400nm波长范围的紫外光。主要是依靠等离子体放电（就是指始终让氘灯处于一个稳定的氘元素（D2或者重氢）电弧状态下。低于190nm波长的紫外光难以被使用的原因是其波长段被氘灯外部的石英套所吸收。

氘灯的正常使用寿命
一个氘灯的使用寿命是指其在提供足够光强的状态下的所使用的小时数。很明显的，一个用来做痕量分析的氘灯的寿命要比做HPLC一类的检测相对简单实验的氘灯寿命要来的短。经验法则告诉我们，当在指定波长下光强不足初始值的50%时，你就可以换氘灯了。
氘灯正常使用时的发射光强是一个很缓慢的减弱过程，可以用以下的指数函数来表示：
It = Io x e-ct
式中：It 表示在t时刻的光强值；
Io 表示初始光强；
C表示一个常数； t表示时间。

氘灯的光强减少量主要取决于以下3个因素：
1.此氘灯的内部金属部件以及涂料的蒸发（同时可能导致灯的能否点亮）；
2.此氘灯的灯丝涂料的材料与石英套发生反应（主要是阻碍穿透）；
3.日晒光照会导致石英套吸收200—250nm波长的光。
当氘灯使用寿命快到时，它发出的光强衰减的会很快一直到它不能点亮为止。如果一直出现点灯失败，那就是氘灯有问题的信号。

导致氘灯使用寿命缩短甚至于早期失效的主要原因是什么？氘灯的开关频率
氘灯的开关次数与其正常使用时间成反比。
以每日工作8小时来说，如果在期间不关灯的话，那你的氘灯寿命会下降三成。
每日在休息等时间将氘灯频繁开关也将对氘灯寿命造成损害，同时可能对生产效率产生影响，因为氘灯点亮后须要30分钟左右的稳定时间。
氘灯的外套受到玷污。
不要用手直接接触氘灯。手上含有的油脂类物质会在石英外套上残留下一个污点，这会阻碍氘灯的光源的发射光。如果不小心用手直接接触到了氘灯，那在氘灯安装之前请用异丙醇将氘灯清洗干净。

物理冲撞
当氘灯或者检测器受到物理冲撞时，如灯是亮着的话，很可能将灯丝弄坏甚至是弄断。（因为当氘灯点亮时其温度有2700K度，此时灯丝几乎是液态的。）
重要提示：在氘灯刚关闭时要等其冷却之后才能再次开启。因为氘灯如果在未冷却状态时被打开，很可能造成灯丝整体结构的破坏。

可更换氘灯的信号：
1.灯的外壳边缘看不见蓝色的光线。（肉眼可见）；
2.石英外套变黑。（灯关时进行检查，冷却并更换）；
3.之前分析方法中从未出现过的非线形现象（光的吸收率不为线形）；
4.在正常设置情况下基线漂移严重；
5.正常进样时不出峰。

氘灯使用时的安全保护措施：
建议戴好紫外光护目镜，因为高能量低波长的紫外光会对肉眼的视网膜造成很大损害。
就算要接触冷的氘灯，也建议戴好防护手套及护目镜。高强度的电弧在冷的时候有0.5个大气压强，可能会内向破裂。
除非你的系统相当稳定，否则建议不要在无人照看情况下使用氘灯。( 来源:色谱网)

泵压力不稳定的原因及其排除方法
处于良好操作状态的泵，应该能使色谱图上的基线平稳；保留时间的重复性好。在等度洗脱时压力波动小于2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢平稳的。

1 在日常使用过程中出现压力不稳的现象。主要原因有几点：
1.1 管路里有气泡。
1.2 输入单向阀失效所致，这也是经常遇见的。
1.3 密封圈磨损导致泄漏所造成。

2 压力不稳的排除方法如下：
2.1 排除管路里气泡的方法是：
打开排空阀，用针筒多抽几下，排出气泡。再用流动相冲洗一段时间。为了加快排出气泡，还可以关紧排空阀，堵住检测器上的背压管，使流通池的压力增加，赶出气泡（但需注意不能压力太高，以免损坏流通池）。

2.2 排除单向阀失效的方法为：
2.2.1 造成单向阀失效原因：
2.2.1.1 泵内残留流动相与宝石球粘连。如长期不使用容易造成类似情况，所以在长期不使用的情况下，应每二周用甲醇作为流动相，开机冲洗1小时，使管路充满。
2.2.1.2 流动相内杂质或其它原因污染了单向阀。虽然流动相是HPLC级的，又经过过滤，但长期使用后仍难免会产生污染。
2.2.2 判断单向阀失效的方法：
2.2.2.1 将泵接上蒸馏水作为流动相。（请勿打开UV检测器与工作站）。
2.2.2.2 打开排空阀，用30 ml的针筒抽出些流动相，确认泵中已有该流动相，然后将针筒内的液体排出，并重新接在排空阀上。
2.2.2.3 将泵设置流量为5ml/min，冲洗5min（注意：此时排空阀仍要打开，否则将冲坏色谱柱）。
2.2.2.4 冲洗完毕后，查看针筒内流动相体积是否为25ml（5×5=25），若正确，则说明该泵在低压情况下无故障；若不正确，则说明该泵中某一单向阀失效（一般多为输入单向阀）。
2.2.2.5 如是双泵梯度分析系统，泵压力不稳一般是其中一台压力不稳所致，可逐个分析。
2.2.3 单向阀失效处理方法：
2.2.3.1 拧下输入单向阀（一共两个）。
2.2.3.2 将2个单向阀放入有蒸馏水的超声波清洗器，清洗10分钟。
2.2.3.3 用冲洗工具冲洗二、三次。冲的时候注意要用手按住单向阀前头，防止把阀内零件冲失。
2.2.3.4 完毕后，将输入单向阀装回原位即可（单向阀是高压部件，须拧紧，防止泄漏）。
若梯度系统两个泵在低压状态下流量都正确，则建议分别将两泵连接上色谱柱进行高压测试。
2.2.4 高压测试具体操作方法：
2.2.4.1 在双泵分析系统连接的前提下（注：不必打开UV检测器），先打开其中一泵（请确认已接好流动相）。
2.2.4.2 设置流量为1ml/min。
2.2.4.3 启动泵。
2.2.4.4 观察运行期间泵的压力是否稳定。若稳定，说明泵无问题；若泵压力不稳，则应检查各管路接头有无泄露，并将有泄漏的接头拧紧；若无泄漏，则问题可能还是出在单向阀上，须再次冲洗单向阀，可反复几次。
2.2.4.5 重复上述步骤，对另一台泵进行高压测试。

2.3 排除密封圈泄漏的方法是：
如仪器使用时间较长或遇到特殊情况（如发生抽干流动相干磨事件、使用了污染的流动相或样品等），都有可能导致密封圈受损，只能更换。

3 预防泵故障的几项措施:
3.1 用HPLC级的流动相和高质量的试剂；
3.2 过滤流动相和试剂；
3.3 脱气；
3.4 每天开始使用时放空排气；
3.5 工作结束后必须冲洗。特别要注意必须从泵中洗去缓冲液；
3.6 不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；
3.7 定期更换密封垫圈；
3.8 需要时加润滑油；
3.9 查阅有关泵操作手册中的其它建议。
3.10 为了能尽快排除故障，平时应常备密封圈、单向阀（输入与输出）、泵头装置、各式接头、保险丝等部件及维护工具。

高效液相色谱柱的选择

现代高效液相色谱中，分离效果好坏的一个重要指标是色谱填料的选择。但是色谱填料的选择范围很宽，因此，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。

一、硅胶基质填料

1、正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。
由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
2、反向色谱 反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。
常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。

二、聚合物填料

聚合物填料多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要优点是在PH值为1—14均可使用。相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。

三、其它无机填料

其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体，由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强，应用范围受到一定限制，所以未能广泛应用。新型色谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH1-14，温度可达100℃。由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行之中。

四、怎样选择填料粒度

目前，商品化的色谱填料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3和5um填料进行。填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3um的填料应用。在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色谱柱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱，即相同的塔板数或分离能力，但是柱长更短，以缩短分析时间。另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。

用HPLC测定头孢氨苄及其制剂含量的各种方法

2005《中国药典》头孢氨苄含量测定项下：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水-甲醇-3.86%醋酸钠溶液-4%醋酸溶液（742：240：15：3）为流动相；检测波长为254nm。头孢氨苄干混悬剂、头孢氨苄片、头孢氨苄胶囊和头孢氨苄颗粒含量测定方法同头孢氨苄。
文献报道的方法（HPLC法），试验条件除药典的水-甲醇-3.86%醋酸钠溶液-4%醋酸溶液系统外，其它的如：
周嘉等用HPLC法测定头孢氨苄胶囊的含量。仪器：岛津LC-10AD 液相色谱仪。色谱柱为Spherisorb C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流动相为0.025mol/L磷酸溶液（用三乙胺调pH3.0±0.1）-乙腈（88：12）；流速为0.9ml/min；检测波长为240nm；柱温为室温。
王建宁等用HPLC法测定头孢氨苄片的含量。仪器：日立L-6200A高效液相色谱仪。色谱柱为C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.04mol/L磷酸溶液(用三乙胺调pH3.0)-乙腈(75：25)；流速：1mL/min；检测波长：240nm；柱温：室温。
程成等用HPLC法测定头孢氨苄胶囊的含量。Waters色谱系统，色谱柱采用Nova Pak ODs柱(4μm，4.6mm×250mm)；流动相为0.01mol/L醋酸铵溶液(冰醋酸调pH4.0)-甲醇(70：30)；流速：0.8ml/min；检测波长262nm；柱温25℃。
周静安等用HPLC法测定头孢氨苄胶囊的含量。仪器：岛津LC-10AD 液相色谱仪。色谱柱为Shim-pack CLC-ODS柱（150mm×6mm）；流动相为甲醇-水（70：30）；流速为1.0ml/min；检测波长为262nm。
邓永辉等HPLC法测定头孢氨苄的含量。仪器：岛津LC-10AD 液相色谱仪。色谱柱：250mm×4.6mm 不锈钢柱，填料为Hypersil ODS；磷酸二氰钾溶液(0.01mol/L)-乙氰-甲醇(90：8：2)，并用磷酸溶液调节PH 至4.5±0.1；检测波长：254mm。
崔慈等用HPLC法测定头孢氨苄的含量。仪器：上海伍丰LC-100液相色谱仪。色谱柱：150mm的C18柱子，以0.025mol/L磷酸溶液（用20%NaOH调节PH至3左右）-乙腈88：12为流动相：检测波长为235nm。

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