〓猪哥哥〓
第1楼2009/03/19
最常用的"万能柱"填料为"C18",简称"ODS"柱,即十八烷基硅烷键合硅胶填料(Octadecylsilyl,简称ODS)。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用,它可完成高效液相色谱70~80%的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相,有较高的碳含量和更好的疏水性,对各种类型的生物大分子有更强的适应能力,因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛。近年来,为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务,又发展了CH、C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶(20~40μm)。 按键合到基质上的官能团可分为: ⑴反相柱:填料是非极性的,官能团为烷烃,例如:C18(ODS)、C8、C4等。 ⑵正相柱:填料是极性的,官能团为-CN氰基、-NH2氨基等。 ⑶离子交换键合相: 阳离子官能团:-SO3H磺酸基、-COOH羧基等。 阴离子官能团:―R4N+季铵基、-氨基等。 ( 由于硅胶基质的键合相只能在pH=2~7.5的范围内使用,而离子交换色谱要求有更宽的pH范围,因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。) 流动相: 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下: H2O<甲醇<乙腈<乙醇<丙醇<异丙醇<四氢呋喃 最常用的流动相组成是:"甲醇-H2O"和"乙腈-H2O",由于乙腈的剧毒性,通常优先考虑"甲醇-H2O"流动相。 反相色谱中,溶质按其疏水性大小进行分离,极性越大疏水性越小的溶质,越不易与非极性的固定相结合,所以先被洗脱下来。流动相的pH对样品溶质的电离状态影响很大,进而影响其疏水性,所以在分离肽类和蛋白质等生物大分子的过程中,经常要加入修饰性的离子对物质,最常用的离子对试剂是三氟乙酸(TFA),使用浓度为0.1%,使流动相的pH值为2~3,这样可以有效地抑制氨基酸上α羧基的离介,使其疏水性增加,延长洗脱时间,提高分辨率和分离效果。 完全离子化的溶质,例如强酸或强碱,其在反相键合相上的保留值很低,近于死时间流出,不能进行分析。根据离子对色谱的原理将一种与样品离子电荷(A+)相反的离子(B-),称为对离子,加入到流动相中,使其与样品离子结合生成弱极性的离子对,即中性缔合物,从而增强了样品的疏水性,加大了保留值,改善了分离效果。 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是: 正己烷<乙醚<乙酸乙酯<异丙醇 其中最常用的是正已烷,虽然其价格较贵,但80%的顺、反和邻位、对位异构体仍然要用正相色谱来进行分离。流动相的选择原则是:①样品易溶,且溶解度尽可能大。②化学性质稳定,不损坏柱子。③不妨碍检测器检测,紫外波长处无吸收。④粘度低,流动性好。⑤易于从其中回收样品。⑥无毒或低毒,易于操作。⑦易于制成高纯度,即色谱纯。⑧废液易处理,不污染环境。
ODP系列色谱柱是聚合物型的C18键合相的反相柱,聚乙烯醇填料耐碱,可以在碱性条件下使用,适合分析某些碱性化合物,耐酸、碱洗,使用寿命长。
各种ODP柱的相关指标如下:
柱名 理论板数 粒径(µm) 尺寸(mm)
ODP-40 4D > 11,000 4 4.6 x 150
ODP-40 4E > 17,000 4 4.6 x 250
ODP-50 6D > 9,000 5 6.0 x 150
ODP-50 6E > 14,000 5 6.0 x 250
ODP-50G 6A 保护柱 5 6.0 x 10
ODP-50 4B >2,500 5 4.6 x 50
ODP-50 4D >9,000 5 4.6 x 150
ODP-50 4E >14,000 5 4.6 x 250
ODP-50G 4A 保护柱 5 4.6 x 10
ODP-50 2D >5,000 5 2.0 x 150
ODP-50G 2A 保护柱 5 2.0 x 10