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【求助】关于反相高效液相色谱使用中遇到关于死时间测定的几个问题

液相色谱(LC)

  • 大家好,有问题想求助一下。描述如下:

    最近在做一个二茂铁衍生物混合物的分离,采用反相高效液相色谱法,使用的是岛津高效液相色谱仪,泵的型号是LC-20AT。我们使用二氯甲烷当溶液,流动相为甲醇-水,柱为C18

    当我们使用等度洗脱的时候,第一个样品峰出现前并无明显的“杂质峰”或者“死体积峰”;换成梯度洗脱,不论以什么样的初始比例在什么样的时间梯度内,约1分钟左右都有一个强度不大,但是还算明显,形状也不错的峰。

    实验所需,我们要知道死时间,查了文献,可以用硝酸钠或者硫脲来做标定死时间的物质,就先使用手头上有的硝酸钠来做标定,溶剂是二氯甲烷。可是实际操作中发现单单走这个硝酸钠溶液也不会有明显的峰出现,是因为硝酸钠在二氯甲烷中溶解性不好导致的吗?

    所以问题为:

    1、色谱柱柱长L=15cm,半径r=4.6mm,流速F=1ml/min,εT0.75。根据死时间的经验公式计算,得出结果为448秒左右。是否太长?

    2、最开始提到的1min左右出一个小峰,这个峰是?可以确定不是样品峰,杂质峰可能性也不大,因为同一瓶溶液,采用自动进样,等度洗脱时不出现,梯度洗脱则必会出现。

    3、是否能提供一下比较具体的死时间测定的方案。

    十分感谢~~~
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  • houcai

    第1楼2010/04/13

    一般出峰时间在3min钟前,定义为溶剂峰或死体积!
    1.死体积计算公式:V0=t0*Fc,与死时间和流动相流速有关!

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  • yukepotato

    第2楼2010/04/13

    要知道司时间干嘛的啊?
    一般3-5分钟之前的峰是溶剂峰,可以走一针空白看看,对比下啊!

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  • 1818

    第3楼2010/04/14

    在进样之前先进一针空白溶剂和流动相各进一针看看!!就可排除干扰了

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  • pan0610

    第4楼2010/04/14

    感谢上面三位朋友,之前在利用公式计算的时候犯了个错误,把柱子的内径0.46直接当成半径来计算了,所以结果太大。重新算了之后为112秒左右。我又用蒸馏水配置了硝酸钠溶液进行死时间的测试,在1.89秒左右出现峰,与计算结果出入不大。
    再次谢谢啦~

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  • sscwxb

    第5楼2010/04/15

    回答第二个问题,可能是流动相的水相有问题。

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  • caroline-

    第6楼2010/04/16

    应该是溶剂峰,每个新品种进样前都应该先进两针溶剂,观察是否有溶剂峰

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  • 微雨燕双飞

    第7楼2010/04/16

    从您的公式里面,只有Fc是设定的,也就是已知的,想要知道V0或t0,必须提前知道V0或C0,所以必须得提前测出两个值才行。
    一般出峰时间在3min钟前,定义为溶剂峰或死体积! ”,没有提供色谱柱规格和测试条件就这样说,岂不是有点武断和经验主义了。

    houcai(houcai) 发表:一般出峰时间在3min钟前,定义为溶剂峰或死体积!
    1.死体积计算公式:V0=t0*Fc,与死时间和流动相流速有关!

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  • 微雨燕双飞

    第8楼2010/04/16

    “yukepotato”朋友提出用溶剂峰来测试是个好办法,当然也可以选择不保留化合物进行测试,比如使用C18柱时采用尿嘧啶进行测试。
    色谱柱的死体积=柱床体积-填料体积=填料间隙体积+填料孔隙体积
    柱床体积很好算,如下:


    V=π×d2×L/4

    π为圆周率,使用3.14即可;L为柱长,单位为cmd为色谱柱内径,单位为cmV为柱床体积体积,单位为mL
    比如250*4.6 mm,5 微米的柱子,柱床体积为4.15 mL。但死体积要明显小于次值,我的测试结果是,在250*4.6 mm,5 微米,100 埃的柱子上,尿嘧啶的洗脱体积为2.05 mL,所以该规格色谱柱的死体积约等于或略小于2.05 mL。
    只要填料均为100 埃的全多孔硅胶,其他规格的色谱柱可以参考本人的测试结果。

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