维权声明：本文为lansusie原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。
一直以来从事定量分析首选的仪器就是三重四级杆，本文尝试使用飞行时间质谱来做一些定量分析的工作。在满足高精度检测的同时在定量准确性方面得到了较好的检测结果。文章标题为
《超高效液相色谱-飞行时间质谱联用法测定人血浆中单硝酸异山梨酯》
目的：建立超高效液相色谱-飞行时间质谱联用法测定人血浆中单硝酸异山梨酯浓度。方法：应用ACQUITY UPLC Hss T3色谱柱（1.8μm 2.1×50mm），以乙腈-0.1%甲酸水为流动相，梯度洗脱进行分离，流速0.5mL/min。采用飞行时间质谱检测器，大气压电喷雾离子源(ESI)，负离子全扫描检测。结果：单硝酸异山梨酯的线性范围为20～1000ng/mL，提取回收率为98.64～108.98 %，日内、日间相对标准差RSD<15%。结论：方法灵敏、快速、重现性好，可用于临床血药浓度监测和药动学研究。
单硝酸异梨酯（Isosorbide-5-mononitrate,5-ISMN）为抗心肌缺血药硝酸异山梨酯（5-ISDN）体内主要活性代谢产物，其主要药理活性是松弛平滑肌，与5-ISDN相比，单硝酸异山梨酯具有吸收迅速、无首过效应、生物利用度高等特点，成为新一代硝酸酯类药。临床上主要用于预防心绞痛，在治疗充血性心力衰竭和血管痉挛性心绞痛等方面应用也日益广泛，疗效优于5-ISDN及硝酸甘油(nitroglycerin, NG)缓释剂。研究表明，5-ISMN血浆t½长，生物利用度高，个体差异小[1]。有关单硝酸异山梨酯血药浓度的测定方法，国内外报道主要有气相色谱法、高效液相色谱法和液-质联用法等，本试验以超高效液相色谱-飞行时间质谱联用法测定血浆中单硝酸异山梨酯浓度，拟建立一种高灵敏度、高效率的测定方法，用于临床血药浓度监测及药动学研究。
1 材料与方法
1.1 仪器
美国WATERS公司ACQUITY UPLC-LCT Premier XE液相色谱-飞行时间质谱联用仪，ESI离子源，QUANLYNX数据处理系统，ASONE TM-2F微型旋涡混合仪（日本ASONE）；VP30真空抽滤泵（北京莱伯泰科）；超高速离心机（长沙平凡科学仪器厂）；氮气吹干仪（杭州奥盛）；JK-3200DB超声波清洗机（合肥金尼克）。
1.2 试剂
乙腈 HPLC（TEDIAK公司）；甲酸 HPLC（TEDIA公司）；乙酸乙酯 AR（西陇）；二氯甲烷 AR（西陇）；超纯水 (MILLI-Q-Reference) 等。
单硝酸异山梨醋对照品批号（100694-200401）对乙酰氨基酚品对照品（100018-200408），由中国药品生物制品检定所提供，空白人血浆由安徽医科大学附属医院血液科提供。
1.3 方法
1.3.1 溶液的配制
1.3.1.1 单硝酸异山梨酯储备液
准确称取干燥至恒重单硝酸异山梨酯对照品适量，置于50mL容量瓶中，用乙腈溶液溶解并稀释，得到一定浓度的单硝酸异山梨酯储备溶液，由于该物质在溶液中不稳定，故现制现用。
1.3.1.2 内标对乙酰氨基酚溶液
精密称取对乙酰氨基酚对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用20:80=乙腈：水溶解并稀释，得到浓度为200µg/mL的对乙酰氨基酚储备溶液。稀释成浓度为1µg/mL的溶液作为内标溶液。
1.3.2 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC Hss T3 1.8μm 2.1×50mm；流动相：0.1%甲酸水溶液，乙腈；梯度洗脱，梯度条件见表1；流速0.5mL/min；柱温：30℃；进样量：10µL。
表1 梯度条件
Tab 1 The conditions of the gradient
时间/min （time） | 流动相比例（rate of mobile phase） |
0.1%甲酸水溶液 (0.1%Formic acid liquid) | 乙腈 （Acetonitrile） |
0 | 90 | 10 |
2 | 10 | 90 |
2.5 | 10 | 90 |
3 | 90 | 10 |
1.3.3 质谱条件
离子源为ESI源；毛细管电压2500V；毛细管温度：350℃；干燥气流速：600L/hr；辅助气流速：10 L/hr；负离子V模式检测；扫描范围：m/z100~1000。单硝酸异山梨酯与对乙酰氨基酚在ESI离子化方式下，主要生成 [M+HCOOH]-和[M-H]-分子离子峰，分别为m/z 236.04和m/z150.05。
1.3.4 血浆样品处理
精确量取200μL血浆，加入内标对乙酰氨基酚标准溶液（1000ng/mL）20μL，涡旋1min。加入3000µL乙酸乙酯：二氯甲烷=80：20的溶液，涡旋1min，4000rpm离心5min，提取上层有机相2550μL，40℃下N2吹干，200μL流动相复溶，12000rpm离心5min，取上清液进样。
2.结论
用UPLC-ToF-MS法测定健康受试者血浆中单硝酸异山梨酯浓度，血浆中杂质峰不干扰样品的测定，线性范围：20～1000ng/mL，最低可定量浓度20ng/mL，提取回收率为98.64～108.98 %，基质效应：94.54～107.70%，批内和批间精密度及准确度的RSD均小于15%，且血浆在室温进样、冻融、长期冷冻下稳定性良好。所以该方法符合单硝酸异山梨酯血浆样品分析要求。
3 讨论
血浆中单硝酸异山梨酯检测方法国内外有HPLC、GC、LC-MS法， 但这些方法有的灵敏度不高，有的分析样品时间较长。本实验采用UPLC-TOF-MS对血浆中单硝酸异山梨酯含量进行检测，UPLC的使用缩短了样品的分析时间，每个样品仅需3min，提高了分析效率，进而大大减少了溶剂的使用量，节约检测成本；同时TOF-MS高分辨质谱的使用，在保证高灵敏度的前提下，提高了检测准确性。因此，本方法适用于临床血药浓度监测及药动学研究。
应助达人
仪器信息网“仪友会”招募令
科学仪器品牌联合“仪器心得”征文活动
【生活中的仪器检测】有奖征文
LC-MS实验瓶颈的突破与优化
