【讨论】你会利用化合物的pKa值来选择流动相的pH值吗？

偶尔会吧
毕竟样品的pKa与流动相的pH一般是非常接近的

一般会怎样选择呢？
或者，有什么选择的规律？

应助达人

一般不用，没有参考文献的话可能会考虑

我们一般不建立新的方法，做得都是仿制药，有标准可参考的。

没有参考文献的话可能会考虑，也可以先配置成溶液，测PH

没有分析方法的参考文献，主要是杂质分析。

什么时候需要缓冲溶液?
　　随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但值得注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的Pka在1-11之间，选择正确的缓冲液PH值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。如果样品的PH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。
　　



如何选择缓冲液PH值？
　　在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：PH=Pka+log([A-]/[A])得知，溶液 PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99%以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。
　　如果选择不到合适的，样品的pKa与流动相的pH非常接近，那么流动相pH微小的变化，都会引起样品保留时间较大的变动。

举例：检测大肠杆菌发酵液中有机酸（主要为乙酸）

流动相的选择依据，流动相的pH值的主要取决于被分离的有机酸的pKa值，乙酸的解离常数是4.76，所用柱子能承受的最低pH值是2，在酸性流动相环境中，如果允许乙酸有1%的离子状态存在，则可预测流动相的pH值。

pH = pKa + Log [Ac^-]/[HAc] = 4.76 + Log 1% = 2.76

由上式可知，流动相的pH值应该是pH 2~2.76之间。配制pH=2.2，2.4，2.6，2.8四种梯度流动相，最后选择pH=2.2的流动相。pH值越小，酸的解离越少，峰形越好。反相C₁₈柱的容许pH范围2.0～8.0，而且磷酸盐在2.1处缓冲容量最大（由于篇幅所限，液相条件探索的色谱图省略处理）。

但是，当化合物只有氨基时，那就十分简单了，大多数氨基化合物pH值小于9时都被质子化，所以所有pH值在7或更低的溶液均适合应用。你也许会问水的 PH值大约是7，为什么还用缓冲盐？因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性，以及色谱峰的尖锐性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析，但我们认为pH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。在一般情况下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好.


应用缓冲液PH值来调节方法选择性?
　　如前面提到的，氨基化合物的保留值随pH的减小而降低，这个特性可以用来调节方法的选择性，如果两个化合物共流出，一个含有氨基，适当改变pH值就可以用来分离这一物质对。由于可离解化合物的选择性依靠pH值，所以变化pH值也可以用来鉴别未知化合物的官能团，如果pH值变小，出峰便快，则化合物中可能存在氨基，当pH变大,化合物出峰很快，或流出在死时间处，化合物可能是一种羧酸，因为羧基离子化后流出大大快于比质子化的中性化合物。