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凯氏(Kjeldahl)定氮法之经验总结

  • 省部重点实验室
    2012/05/09
  • 私聊

定氮仪

  • 摘要:本文主要针对应用凯氏定氮法测定蛋白质的原理及其具体的消化、蒸馏和滴定过程中的各个细节及其相应的注意事项进行总结,为从事蛋白质测定工作的检测人员提供参考和帮助。

    关键词:蛋白质 测定原理 注意事项



    the Experimental Summary of Kjeldahl Nitrogen Determination Methods

    Zhangguozhi Jinan Hanon Instruments Co., Ltd



    Abstracts: This article mainly aimed at Mirco-Kjeldahl determination methods and the digestion, distillation and titration process. Summarized the experimental details and their corresponding notes.for the inspection staff in such work provides reference and help.

    key word: Protein, nitrogen determination, notes





    以凯氏定氮法测定氮含量换算蛋白质的方法,是国际上通用的标准方法,操作简单,测定结果重复性和重现性都很好,广泛用于各种食品、谷物、饲料等样品的蛋白质含量测定。此法又分为常量、半微量、微量法三种。国家标准规定为半微量凯氏定氮法。其测定原理相同,主要区别在于常量法的样品及试剂用量较微量法多。而微量法则具有实验规模小,实验费用低的优点。但微量法的准确度和精密度比常量法要差一些。凯氏定氮法整个测定过程分为消解、蒸馏、滴定三步。

    要使测定结果有更好的正确度、准确度和精准度,认真细致掌握测定的每个步骤、各个细节及相应的注意事项,就显得尤为重要。本文就此进行深入的探讨。
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  • 省部重点实验室

    第1楼2012/05/09

    一、 原理

    蛋白质是含氮的有机化合物。样品与硫酸和催化剂一同加热消化,使蛋白质分解,分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质含量。

    1.消化

     有机物中的胺根在强热和CuSO4,浓H2SO4 作用下,硝化生成(NH4)2SO4

      反应式为:

    2NH2+H2S04+2H+(NH4)2S04 (其中CuSO4做催化剂)

    2.蒸馏

     在凯氏定氮器中与碱作用,通过蒸馏释放出NH3 ,收集于H3BO3 溶液中

      反应式为:

      (NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO4

    2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O

    3.滴定

    用已知浓度的H2SO4(或HCI)标准溶液滴定,根据HCI消耗的量计算出氮的含量,然后乘以相应的换算因子,既得蛋白质的含量

      反应式为:

      (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O(NH4)2SO4+4H3BO3

      (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO3

    二、实验过程操作

    1、主要试剂的配制

    40%氢氧化钠:化学纯 400g氢氧化钠溶于1000ml无氨蒸馏水中。

    2%硼酸:分析纯 20g硼酸溶于1000ml无氨蒸馏水中。

    0.05mol/L盐酸:分析纯 4.2ml盐酸定容至1000ml,通过无水碳酸钠标定。



    混合指示剂把溶解于95%乙醇的0.l%溴甲酚绿溶液5份和溶于95%乙醇的0.l

    甲基红溶液1份混合而成.

    2、实验过程注意事项

    1 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀,液体样品应振摇或搅拌均匀。

    固体样品一般取样范围为0.20g~2.00g;半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g;液体样品取样10.0mL~25.0mL(约相当氮30mg~40mg)。若检测液体样品,结果以g/100mL表示。

    样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀,液体样品应振摇或搅拌均匀。

    2 样品放入定氮瓶内时,不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下,以免被检样消化不完全,结果偏低,或者用滤纸包裹好一起投入消化,滤纸影响通过空白扣除。消化时应注意旋转凯氏烧瓶,将附在瓶壁上的碳粒冲下,对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明,可将凯氏烧瓶中溶液冷却,加入数滴过氧化氢后,再继续加热消化至完全。

    3)消化时,不要用强火。若样品含糖高或含脂及较多时,注意控制加热温度,以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶,造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡,或硅消泡剂减少泡沫产生。在整个消化过程中保持和缓的沸腾,使火力集中在凯氏瓶底部,以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下,使氮有损失。海能公司消解炉SH220SH520能够很好的解决此问题。

    4)如硫酸缺少,过多的硫酸钾会引起氨的损失,这样会形成硫酸氢钾,而不与氨作用。因此,当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时,要增加硫酸的量;加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点;催化剂硫酸铜在有机物全部消化后,溶液显清澈透明的蓝绿色,可用它来指示消化终点。此外,硫酸铜还可用做下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。 过氧化氢,为氧化剂,有助于有机物消化,同时可以消除消化过程中的气泡现象。

    5)向蒸馏瓶中加入浓碱时,往往出现褐色沉淀物,这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应,生成氢氧化铜,经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用,生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]2+ 加入氢氧化钠是否足量,常常影响整个测定的顺利进行。由反应原理可知,当氢氧化钠足量时有黑色氧化铜生成而使溶液呈淡黑色;当氢氧化钠量不足时就无黑色氧化铜产生而使溶液呈淡蓝色,所以有无氧化铜颜色存在是判断氢氧化钠是否足量的标志。

    6)因蒸馏时反应室的压力大于大气压力,故可将氨带出。所以,蒸馏时,蒸气要发生均匀,充足,蒸馏中不得停火断气,否则,会发生倒吸。停止蒸馏时,由于反应室外层的压力突然降低,可使液体倒吸入反应室外层,所以,操作时,应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口,再蒸一分钟后关掉热源。蒸馏是否完全,可用精密PH试纸测冷凝管口的冷凝液来测定,中性则说明已蒸馏完全。一般情况下建议使用半微量法,因为如果蒸馏失败的话,半微量法还可继续蒸馏,而常量法只好全部重来,费时费力。我们使用海能K9840经过多次蒸馏吸收实验达到理想效果。

    7)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿,可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

    8)吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸,过剩的酸液用0.01N碱液滴定,而以硼酸为氨的吸收液,可省去标定碱液的操作,且硼酸的体积要求并不严格,亦可免去用移液管,操作比较简便。另外,硼酸吸收液的温度不应超过40℃,否则氨吸收减弱,造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。

    9在盐酸标准溶液的配制时,必须将基准无水碳酸钠于270-300℃灼烧至恒重后称取所须用量,否则也会影响蛋白质测定结果的准确性。盐酸标准溶液的浓度,常量法中取0.1M比较合适,半微量法中则在0.020.05M之间比较合适。

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  • 省部重点实验室

    第2楼2012/05/09

    三、讨论

    凯氏定氮法作为目前法定的国标方法与我们的工作密不可分,本文主要通过综述凯氏定氮法操作的细节及注意事项,为关注此检测方法的从业人员提供一定的帮助,从而有效的提高效率。



    主要参考文献

    [1]GB 5009.5-2010 食品中蛋白质的测定 中国标准出版社,2010.3.26

    [2]寇云娟,谭源,韩起文. 牛奶中蛋白质的测定原理及其注意事项<<中国乳业>>20067.

    [3]蛋白质测定实验研究[J]实验室研究与探讨,2005, 24(4): 58-59

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