凯氏（Kjeldahl）定氮法之经验总结

一、 原理

蛋白质是含氮的有机化合物。样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

1.消化

　有机物中的胺根在强热和CuSO₄，浓H₂SO₄ 作用下，硝化生成(NH₄)₂SO₄

　　反应式为：

2NH₂^—+H₂S0₄+2H⁺＝(NH₄)₂S0₄ （其中CuSO₄做催化剂）

2.蒸馏

　在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH₃ ，收集于H₃BO₃ 溶液中

　　反应式为:

　　(NH₄)₂SO₄+2NaOH＝2NH₃+2H₂O+Na₂SO₄

2NH₃+4H₃BO₃＝(NH₄)₂B₄O₇+5H₂O

3.滴定

用已知浓度的H₂SO₄（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量

　　反应式为：

　　(NH₄)₂B₄O₇+H₂SO₄+5H₂O＝(NH₄)₂SO₄+4H₃BO₃

　　(NH4)₂B₄O₇+2HCl+5H₂O＝2NH₄Cl+4H₃BO₃

二、实验过程操作

1、主要试剂的配制

40%氢氧化钠：化学纯 400g氢氧化钠溶于1000ml无氨蒸馏水中。

2%硼酸：分析纯 20g硼酸溶于1000ml无氨蒸馏水中。

0.05mol/L盐酸：分析纯 4.2ml盐酸定容至1000ml，通过无水碳酸钠标定。



混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液5份和溶于95％乙醇的0.l％

甲基红溶液1份混合而成．

2、实验过程注意事项

（1） 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

固体样品一般取样范围为0.20g~2.00g；半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g；液体样品取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30mg~40mg）。若检测液体样品，结果以g/100mL表示。

样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

（2） 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低，或者用滤纸包裹好一起投入消化，滤纸影响通过空白扣除。消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。

（3）消化时，不要用强火。若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。在整个消化过程中保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。海能公司消解炉SH220或SH520能够很好的解决此问题。

（4）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量；加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点；催化剂硫酸铜在有机物全部消化后，溶液显清澈透明的蓝绿色，可用它来指示消化终点。此外，硫酸铜还可用做下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。 过氧化氢，为氧化剂，有助于有机物消化，同时可以消除消化过程中的气泡现象。

（5）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu(NH₃)₄]²⁺ ， 加入氢氧化钠是否足量,常常影响整个测定的顺利进行。由反应原理可知，当氢氧化钠足量时有黑色氧化铜生成而使溶液呈淡黑色；当氢氧化钠量不足时就无黑色氧化铜产生而使溶液呈淡蓝色，所以有无氧化铜颜色存在是判断氢氧化钠是否足量的标志。

（6）因蒸馏时反应室的压力大于大气压力，故可将氨带出。所以，蒸馏时，蒸气要发生均匀，充足，蒸馏中不得停火断气，否则，会发生倒吸。停止蒸馏时，由于反应室外层的压力突然降低，可使液体倒吸入反应室外层，所以，操作时，应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸一分钟后关掉热源。蒸馏是否完全，可用精密ＰＨ试纸测冷凝管口的冷凝液来测定，中性则说明已蒸馏完全。一般情况下建议使用半微量法，因为如果蒸馏失败的话，半微量法还可继续蒸馏，而常量法只好全部重来，费时费力。我们使用海能K9840经过多次蒸馏吸收实验达到理想效果。

（7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

（8）吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，而以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。另外，硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。

（9）在盐酸标准溶液的配制时，必须将基准无水碳酸钠于270-300℃灼烧至恒重后称取所须用量，否则也会影响蛋白质测定结果的准确性。盐酸标准溶液的浓度，常量法中取0.1M比较合适，半微量法中则在0.02～0.05M之间比较合适。