请各位提供一些梯度洗脱需要注意的地方！

梯度时间范围太小了，

时间 0 7.5 12.5 20 30 35 40 45

甲醇比例 35 35 30 30 60 60 35 35

是不是设计的很业余？

1、要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和 1mol/L的醋酸铵(pH5.16)做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

2、梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辩认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头上后会被强的溶剂洗脱出来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止溶剂混合时产生气泡。

3、混合溶剂的粘度常随组成而变化，因此在梯度洗脱时常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。

4、每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始的状态。需让10～30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。

那一段陡的厉害些？把他放缓试试

doublezho(doublezho) 发表:时间 0 7.5 12.5 20 30 35 40 45

甲醇比例 35 35 30 30 60 60 35 35

是不是设计的很业余？

楼主把截图发上来看看

做梯度之前一定要充分了解所使用的仪器，包括泵和系统死体积，四元泵需要的平衡时间比二元泵长得多，死体积越大需要的平衡时间也更长，必要时可以减小混合器的体积；若重现性太差，基线噪音过大，需要添加混合器。还需要考虑缓冲试剂的吸光度，以控制基线漂移，根据基线漂移的趋势调整A,B相中缓冲试剂的量。