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酵母双杂感受态的制备及转化

  • 省部重点实验室
    2013/01/16
  • 私聊

生命科学仪器综合讨论

  • 酵母感受态的制备:
    1. 取500-1000微升的酵母感受态菌株,加入到3到5毫升的新YPDA培养基中,30度震荡5-8小时,250rpm
    2. 取5微升摇好的感受态菌液加到25-50毫升的新YPDA培养基中,30度震荡培养15-20小时,浓度0.15-0.3(视情况想快点可多取点少摇一会)
    3. 离心700g,5分钟室温下,倒掉上清加入25-100毫升的新YPDA培养基,把菌体摇起来摇匀,30度震荡培养3-5小时
    4. 离心700g,5分钟室温下,倒掉上清,无菌水重悬(5-10毫升)
    5. 离心700g,5分钟室温下,倒掉上清,1.5毫升(1倍TE和LiAc的混合液)重悬,并转移到2毫升的离心管中
    6. 高速离心15秒(12000就可以)去上清加入50微升乘以感受态管数的量(1倍TE和LiAc的混合液)重悬并分装。
    感受态已制成
    7. 吸取50微升感受态到1.5或2.0的离心管中,加入5到15微升的质粒100ng(及5微升的carrier DNA有了加没有可以不加)
    8. 加入500微升的PEG/LiAc(1倍TE和LiAc、 PEG 40%的混合液)轻轻混匀
    9. 30培养30min,10分钟震荡一次
    10. 加入20微升的DMSO混匀
    11. 42度热激15min,每5min混匀一次
    12. 高速离心15秒,去掉上清加入500-800微升的YPDA或YPD plus重悬,30度培养,(转化时是可选步骤,筛库转化时需要培养90min)
    13. 离心去上清,以0.9%的生理盐水重悬。(可选步骤)
    14. 吸取100微升涂板,pGBKT→SD/-Trp→Y2H pGADT→SD/-Leu→Y187
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