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酵母双杂感受态的制备及转化

省部重点实验室

2013/01/16

生命科学仪器综合讨论

酵母感受态的制备:
1. 取500-1000微升的酵母感受态菌株，加入到3到5毫升的新YPDA培养基中，30度震荡5-8小时，250rpm
2. 取5微升摇好的感受态菌液加到25-50毫升的新YPDA培养基中，30度震荡培养15-20小时，浓度0.15-0.3（视情况想快点可多取点少摇一会）
3. 离心700g，5分钟室温下，倒掉上清加入25-100毫升的新YPDA培养基，把菌体摇起来摇匀，30度震荡培养3-5小时
4. 离心700g，5分钟室温下，倒掉上清，无菌水重悬（5-10毫升）
5. 离心700g，5分钟室温下，倒掉上清，1.5毫升（1倍TE和LiAc的混合液）重悬，并转移到2毫升的离心管中
6. 高速离心15秒（12000就可以）去上清加入50微升乘以感受态管数的量（1倍TE和LiAc的混合液）重悬并分装。
感受态已制成
7. 吸取50微升感受态到1.5或2.0的离心管中，加入5到15微升的质粒100ng（及5微升的carrier DNA有了加没有可以不加）
8. 加入500微升的PEG/LiAc（1倍TE和LiAc、 PEG 40%的混合液）轻轻混匀
9. 30培养30min，10分钟震荡一次
10. 加入20微升的DMSO混匀
11. 42度热激15min，每5min混匀一次
12. 高速离心15秒，去掉上清加入500-800微升的YPDA或YPD plus重悬，30度培养，（转化时是可选步骤，筛库转化时需要培养90min）
13. 离心去上清，以0.9%的生理盐水重悬。（可选步骤）
14. 吸取100微升涂板，pGBKT→SD/-Trp→Y2H pGADT→SD/-Leu→Y187

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