高效液相色谱梯度洗脱时应该注意的问题

我先来抛砖引玉哈。
首先是实验前需要充分的平衡色谱柱；其次是目标组分峰要与梯度洗脱溶剂峰很好地分好，需要注意有机相与水相比例变化时压力的上限。

溶剂还是需要很好地脱气，由于梯度洗脱是在线混合，所以要注意两种（或以上）不同溶剂混合时，可能产生的气泡。

下面衔接是dahua1981老师的帖子，里面有他的见解：
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20130301/4593729/

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梯度洗脱时应该注意的一些问题

（1）要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵（PH 5.16）做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶，甲醇和乙烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

（2）梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头上后会被强的溶剂洗脱出来，用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止溶剂混合时产生气泡。

（3）混合溶剂的黏度常随组成而变化，因此在梯度洗脱时常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的黏度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时黏度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。因此要防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。

（4）每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始的状态。需让10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相和初始流动相达到完全平衡。

（5）注意梯度洗脱用水的有机物残留，往往在等度洗脱时用的水，在梯度洗脱时发生问题（鬼峰），这是因为在梯度过程中，水占的比例很高时的流动相洗脱能力很低，此时水中的有机物残留就被色谱柱吸附并浓缩，等到强溶剂占高比例时，浓缩的有机物被高洗脱能力的流动相洗脱而流出色谱柱，并成为一个色谱峰，从而干扰分析。

总结的非常好。