标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量

省部重点实验室

2013/10/13

私聊

生命科学仪器综合讨论

一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法

1. 凯氏定氮法

2. 双缩脲法

3. Folin-酚试剂法

4. 紫外吸收法

5. 考马斯亮蓝法

三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作

（一）试剂：

1. 考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇，加入100 ml 85% H₃ PO₄ ，雍蒸馏水稀释至1000 ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H₃ PO₄ 。

2. 标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15 mol/LNaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。

（二）器材：

1. 722S型分光光度计使用及原理。

2. 移液管使用。

（三）标准曲线制作：
1.

试管编号	0	1	2	3	4	5	6
100ug/ml标准蛋白（ml）	0.0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6
0.15mol/L NaCl （ml）	1	0.9	0.8	0.7	0.6	0.5	0.4
考马斯亮蓝试剂（ml）	5	5	5	5	5	5	5
摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色
A_595nm

2. 以A_595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

（1）利用标准曲线查出回归方程。

（2）用公式计算回归方程。

（3）或用origin作图，测出回归线性方程。即A_595nm =a×X( )+6；一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

（4）绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

（四）蛋白质含量的测定：
样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A_595nm ，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A_595nm 值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A_595nm 值太大，可以稀释后再测A_595nm值，然后再计算。

（五）注意事项：

1. 玻璃仪器要洗涤干净。

2. 取量要准确。

3. 玻璃仪器要干燥，避免温度变化。

4. 对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

蛋白质含量测定实验

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实验材料

结晶牛血清清蛋白 g—球蛋白

试剂（盒）