细胞计数实验中初学者易犯的错误

省部重点实验室

2014/01/07

私聊

生命科学仪器综合讨论

本实验的主要目的是掌握利用血球计数板测定细胞培养中细胞的数目，即细胞计数，细胞计数最关键的步骤是制制备均匀的细胞悬液。这里总结了细胞计数的操作步骤以及一些初学者常犯的错误。

实验原理：

当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作：

一、准备工作：

取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养(消化法)》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。

二、细胞悬液制备：

用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液)，吹打制成待测细胞悬液。

三、细胞计数：

1. 取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.

2. 制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑。活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。

3. 将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

4. 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。

5. 计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：

细胞悬液的细胞数/ml=(四个大格子细胞数/4)×2×10⁴

说明：/4因为计数了4个大格的细胞数;×2因细胞悬液：染液=1：1稀释;×10⁴因为计数板中每一个大格的体积为：1.0 mm×1.0 mm×0.1 mm=0.1 mm³ 而 1 ml=1000 mm³

四、细胞计数要点：

1. 进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于10⁴个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;

2. 要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

3. 取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确;

4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。

5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

五、初学者易犯的错误：

1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。

2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。

六、本实验特殊试剂的配制：

4%台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4 ℃保存。

使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4%即可。

细胞的冻存

1. 先将冻存管放入4 ℃冰箱，约40 min。

2. 接着置于-20 ℃冰箱，约30-60 min。

3. 置于-80超低温冰箱中放置过夜。

4. 置于液氮罐中长期保存。

5. 同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。

注意事项：

1. 使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。

2. 不宜将冻存细胞放置在0 ℃～-60 ℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。

3. 注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。

简便方法：

胰蛋白酶液消化>>离心>>PBS液1 ml洗涤，吹打制成待测细胞悬液>>取1 ul悬液+9 ul PBS>>细胞计数：

1. 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.

2. 用10 ul枪头将细胞悬液注入计数板，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

3. 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)的细胞数目。

4. 计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度： (细胞悬液的细胞数)/ml=(四个大格子细胞数/4)×10⁶

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