分离的难题

用甲醇乙腈水试试。

换根不同长度色谱柱！

应助达人

是不是梯度改变的时间太晚了，毕竟溶剂转换色谱柱也有个适应的过程，相当于活化的过程，可以早一点改变梯度浓度，还有上面有童鞋讲的，可以降低流动相的极性

不明白楼主为何要先用高比例有机相到低比例有机相梯度，这样不是正常的条件，所以可以看到你用这个条件后面的峰都是矮胖峰，并且还能发现有两个物质在75%乙腈等度方法中没有分开。
如果是我需要优化方法，我会尝试60%乙腈，20分钟后升到80%。但是这样估计不能解决问题。所以，可以尝试下一楼三人行老师说的，在流动相中加入一定量的甲醇试试，也许能增加些选择性。

谢谢回复，有些问题还想请教一下
1、先75%再60%的梯度是想先用75%分开3、4号峰，再用60%分开12、13号峰，但实际却不行，只能先低后高吗？
2、甲醇乙腈水的话，大概是怎样的比例？

应助达人

这种情况换梯度估计也够呛，换柱子试试

看样子楼主还不太明白反相HPLC的分离原理，可以多了解下。在反相HPLC中，物质的保留是和有机相比例呈反比的，有机相越多，保留越弱，反之越强。所以如果你一开始就尝试大比例的有机相，那么一些物质的保留就减弱，分离度也就随之降低。所以RP-HPLC都是从小比例有机相过度到大比例有机相的。

对于RP-HPLC来说，不同的有机溶剂，其洗脱能力是不一样的，对于一些化合物的选择性也不一样（具体表现为保留时间、分离度），所以，当你的方法中有2个峰分离度不好时，可以尝试使用其他溶剂，比如甲醇或四氢呋喃，说不定会有惊喜。但是更换溶剂时，需注意方法中化合物的稳定性，有些物质在甲醇中可能不稳定。

但是，这些都是很麻烦的事情，楼主你一直没说明用的是什么色谱柱。如果你使用的是15cm的柱子，那么换个25cm的柱子是个不错的选择，很有可能立刻就解决问题了。

谢谢，柱子是ODS的250mmX4.6mmX5um

不知道，这些峰都是什么成分，考虑换固定相吧