液相流动相配置问题（相同配置方法，分离结果差异）

yukizhang

2014/12/28

私聊

液相色谱（LC）

赏
悬赏金额:10积分状态:已解决

液相流动相A、B相均由乙腈-甲醇-缓冲溶液组成，只是比例不一。但是配置得到的不同批次流动相，在分离目标体系（比较复杂）时，峰的分离结果不一
90min的梯度洗脱程序，在50-55min区段内两峰理想时R=1.0，不理想时两峰共洗脱成一个峰。

流动相配置时：
为了减少批次间的差异，用容量瓶进行缓冲盐溶液的配置（缓冲体系是KH2PO4-H3PO4)
每次调节pH前均会校准pH计
量取乙腈、甲醇和缓冲盐时用同一量筒以确保比例的准确

因为分离结果直接与不同批次有关，不存在同一批次的流动相分离结果有好有坏，所以应该不会是柱效的降低、流动相脱气不充分等问题

想请问造成不同批次流动相下分离效果差异的原因还有哪些，出现这样的问题是不是说明缓冲体系的缓冲容量不够呢？应该怎么解决？

Ps：
Buffer: 10.2 g of monobasic potassium phosphate in a 1000-mL volumetric flask. Dissolve in 950 mL of water. While stirring, adjust with phosphoric acid to a pH of 3.1, and dilute with water to volume.
Solution A: Acetonitrile, methanol, and Buffer (20:5:75)
Solution B: Acetonitrile, methanol, and Buffer (20:30:50)

dywzqbx 2014/12/30

[quote]原文由 [b]yukizhang(yukizhang)[/b] 发表: [quote]原文由 [b]dywzqbx(dywzqbx)[/b] 发表: （1）盐的浓度已经够大的了，缓冲容量应该不用怀疑。（2）可能原因：1）待分析物质的pKa值在3.1附近 [/quote] 那请问遇到这种情况，需要怎么解决呢？[/quote] 建议下次记得上图，留下梯度程序，信息越全，他人才能更准确的给你建议。以下是我的分析：分析时间90min，目标峰在50min出峰，缓冲盐的浓度应该在30 mmol以上。假设你的色谱条件完全相同，使用的仪器、色谱柱、流动相的配置等。缓冲盐的浓度比较大，缓冲容量不成问题。分析方法的来源，是自己摸索还是有可依靠的标准。（1）若是可靠标准，检查所有项与标准相关的内容，确保完全一致。 1）因为每个瓶里的流动相是多种物质混合，应流动相注意搅匀，超声无效果，最好用磁力搅拌器搅拌5~10min。（2）自己摸索的方法：这么长时间应该是梯度洗脱，可能存在以下问题 1）缓冲盐的浓度偏大，流动相中若有大比例的有机相，尤其是乙腈出现时，可能会使盐析出而发生压力升高，从而影响结果，可以看看每次实验的条件下压力是否稳定，有没有明显的压力差。 2）测定化合的pH值，确定缓冲液的pH是否适当。不排除仪器抽经的问题，但概率极小。

分
该帖子已被版主-夏天的雪加2积分，加2经验;加分理由:鼓励发帖

相关话题

+关注

私聊

夏天的雪

第1楼2014/12/29

应助达人

怀疑还是流动相配制的关系，例如配制时浓度或pH调节有差异

+关注

私聊

dywzqbx

第2楼2014/12/30

应助达人

（1）盐的浓度已经够大的了，缓冲容量应该不用怀疑。
（2）可能原因：1）待分析物质的pKa值在3.1附近

+关注

私聊

浪淘沙隐

第3楼2014/12/30

我觉得泵的混合能力也值得考虑下。我以前一个同事说，0.1mol/ml的缓冲液在岛津四元泵上根本做不了，但是在agilent上可以做；我也有一个项目，两个杂质在agilent上分离度大于2.0，挪到岛津和waters上做就出一个峰（其中有一台岛津能分开，分离度1.0）。

+关注

私聊

yukizhang

第4楼2014/12/30

那请问遇到这种情况，需要怎么解决呢？
dywzqbx(dywzqbx) 发表:（1）盐的浓度已经够大的了，缓冲容量应该不用怀疑。
（2）可能原因：1）待分析物质的pKa值在3.1附近

+关注

私聊

yukizhang

第5楼2014/12/30

我能说我非常赞同你的看法吗！但是因为条件有限，现在只能在现有的仪器上进行方法开发。

我们这台仪器是某一批流动相是能分开的，但是换了一批就可能分不开了，所以总体分离不那么好是和仪器有关，但是分离结果和流动相批次直接相关来看，问题应该还是在流动相上。
浪淘沙隐(zhoujin83) 发表:我觉得泵的混合能力也值得考虑下。我以前一个同事说，0.1mol/ml的缓冲液在岛津四元泵上根本做不了，但是在agilent上可以做；我也有一个项目，两个杂质在agilent上分离度大于2.0，挪到岛津和waters上做就出一个峰（其中有一台岛津能分开，分离度1.0）。

+关注

私聊

dywzqbx

第6楼2014/12/30

应助达人

建议下次记得上图，留下梯度程序，信息越全，他人才能更准确的给你建议。

以下是我的分析：分析时间90min，目标峰在50min出峰，缓冲盐的浓度应该在30 mmol以上。

假设你的色谱条件完全相同，使用的仪器、色谱柱、流动相的配置等。缓冲盐的浓度比较大，缓冲容量不成问题。

分析方法的来源，是自己摸索还是有可依靠的标准。

（1）若是可靠标准，检查所有项与标准相关的内容，确保完全一致。

1）因为每个瓶里的流动相是多种物质混合，应流动相注意搅匀，超声无效果，最好用磁力搅拌器搅拌5~10min。

（2）自己摸索的方法：这么长时间应该是梯度洗脱，可能存在以下问题

1）缓冲盐的浓度偏大，流动相中若有大比例的有机相，尤其是乙腈出现时，可能会使盐析出而发生压力升高，从而影响结果，可以看看每次实验的条件下压力是否稳定，有没有明显的压力差。

2）测定化合的pH值，确定缓冲液的pH是否适当。

不排除仪器抽经的问题，但概率极小。
yukizhang(yukizhang) 发表:那请问遇到这种情况，需要怎么解决呢？

+关注

私聊

小虾米

第7楼2014/12/31

还有这个区别？
浪淘沙隐(zhoujin83) 发表:我觉得泵的混合能力也值得考虑下。我以前一个同事说，0.1mol/ml的缓冲液在岛津四元泵上根本做不了，但是在agilent上可以做；我也有一个项目，两个杂质在agilent上分离度大于2.0，挪到岛津和waters上做就出一个峰（其中有一台岛津能分开，分离度1.0）。