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探索测试甲醛的制样方法不同导致结果出现差异？

Flynnchen

2016/08/20

液相色谱（LC）

甲醛的测定高效液相色谱法一：
一、步骤
1、试剂
除特别要求外，所用水应符合GB/T6682中一级水的要求。
1.1. 乙腈，色谱纯；
1.2.磷酸，色谱纯；
1.3. 2，4-二硝基苯肼：≥97%；
1.4.甲醛-2，4-二硝基苯肼腙：（标准品，浓度1.0mg/mL）；
1.5.衍生化试剂：称取0.1g（精确至0.1mg）的2，4-二硝基苯肼于1000ml棕色容量瓶中，加入6ml磷酸，乙腈定容至刻度（即浓度为100ug/ml）。
2、仪器条件
2.1，柱温：30℃；
2.2，流速：0.5mL/min；
2.3，进样量：10uL；
2.4，检测波长：352.0nm；
2.5，梯度洗脱，流动相为水和乙腈；
梯度洗脱程序见表1。
时间，min 流动相水，% 流动相乙腈，%
0 70 30
5 10 90
13 70 30
15 70 30
3、标准溶液
用移液枪准确移取0.5ml浓度为1.0mg/mL的甲醛-2，4-二硝基苯腙（1.4.）于50mL容量瓶中，乙腈定容，定为第1级标准溶液。
取第1级标准溶液20mL于50mL容量瓶中，乙腈定量至刻度，定为第2级标准溶液；
取第2级标准溶液20mL于50mL容量瓶中，乙腈定量至刻度，定为第3级标准溶液；
取第3级标准溶液20mL于50mL容量瓶中，乙腈定量至刻度，定为第4级标准溶液；
取第4级标准溶液20mL于50mL容量瓶中，乙腈定量至刻度，定为第5级标准溶液；
取第5级标准溶液20mL于50mL容量瓶中，乙腈定量至刻度，定为第6级标准溶液；
各级标准溶液浓度示例如表1，各级标准溶液尝试需根据标准品标定浓度具体计算。
标准溶液贮存于0～4℃的冰箱内，取用时放置于常温下，达到室温后方可使用，有效期3个月。
表2 工作标准溶液系列
系列标准浓度 1 2 3 4 5 6
甲醛腙尝试 10 4 1.6 0.64 0.256 0.102
mg/L
相当于甲醛浓度 1.429 0.571 0.229 0.0914 0.0366 0.0146
mg/L
4、标准工作曲线绘制
分别取标准溶液（三、标准溶液）进行HPLC分析，根据标准溶液的浓度及甲醛响应峰面积作甲醛的标准工作曲线，工作曲线线性相关系数R²≥0.99。
每次测试均需制作标准曲线，每20次样品测定后应进入一个中等浓度的标准溶液，如果测得的值与原值相差超过3%，则应重新进行标准曲线的制作。
5、样品制备
准确称取0.5g试样（精确至0.1mg）于50ml的具塞三角瓶中，加入25.0mL水后置于振荡器上，振荡萃取15min（振荡仪的最低转速下）。准确移取5.0mL萃取液至离心管，于20℃离心20min,转速12000rpm/min。静置后准确移取1.0mL上清液于10mL容量瓶中，加入4mL的衍生化试剂(1.5.)后用乙腈定容到刻度，静置15min进行衍生化。然后用0.45um的有机滤膜过滤，滤液进入HPLC按2、仪器条件分析。（制样过程共花费50分钟）
由保留时间定性，外标法定量；每个样品重复测定两次。同时每批样品做一组空白。
若被测试样溶液的浓度超出标准工作曲线浓度范围，可减少样品的称样量。
6、空白试验
不加样品，重复5、操作，进行HPLC分析。
7、结果与计算的表达：
试样中的甲醛含量按下式进行计算：
Xi=(Ci-C0)×V×S/m
式中：Xi——试样中甲醛的含量，单位为mg/kg;
Ci——由标准工作曲线中得出的甲醛浓度，单位为mg/L；
C₀——由标准工作曲线中得出的空白值，单位为mg/L；
V——萃取液体积，单位为mL；
S——试样溶液的稀释因子；
m——试样质量，单位为g。
二、回收率、检出限和定量限
本方法的回收率要求、检出限和定量限见表3。
表3 方法的回收率要求、检出限和定量限
化合物回收率，% 检出限，mg/kg 定量限，mg/kg
甲醛 91.0～105.7 1.6 5.3

三、测试结果如下：
甲醛的值为：1.28337ug/kg。

甲醛的测定高效液相色谱法二：
一、样品制备与甲醛的测定高效液相色谱法不同其余部分完全相同
准确称取0.1g试样（精确至0.1mg）于50ml的具塞三角瓶中，加入10mL的衍生化试剂浓度为200ug/ml（与方法一不同）后用乙腈定容到刻度后置于振荡器上，振荡萃取30min（振荡仪的最低转速下）进行衍生化。然后用0.45um的有机滤膜过滤，滤液进入HPLC按2、仪器条件分析。（制样过程共花费30分钟）
由保留时间定性，外标法定量；每个样品重复测定两次。同时每批样品做一组空白。
若被测试样溶液的浓度超出标准工作曲线浓度范围，可减少样品的称样量。
二、测试结果如下：
甲醛的值为：18.3347ug/kg，

总结是什么原因导致这两个样品的结果不同的呢？
做了如下分析：
可能性1，可能是甲醛溶于水而致使萃取不充分？
因为制样方法一用25ml水溶解，而方法二未用水溶解。但是以前用两种不同的制样方法所测试的结果完全是一样的，所以可以排除这一可能性。
可能性2，可能是测试这两个样品时，仪器的响应信号差异太大而导致的？
因为样品结果的定量使用的是外标法，仔细将两个色谱图重叠起来对比后发现两张色谱图的响应信号不一样如下图。

从重叠后的两张色谱图上可以看出两次样品的溶剂峰响应值是不一样的，但是蓝线的溶剂浓度为200ug/ml，而红线溶剂的浓度为40ug/ml，
所以从溶剂峰的响应信号高低来判断，也说明两次相应的信号相对是平稳的，故而排除仪器的响应信号差异的这一说法。
可能性3，可能是甲醛萃取时间的不同导致的结果出现差异？
因为制样方法一共用了50分钟，而制样方法二只用了30分钟，所以导致结果出现很大的差异。
结论，可能性3是导致差异的最大原因。

分
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Flynnchen

第1楼2016/08/21

应该是甲醛有一定的挥发性吧！

0

yifan1117

第2楼2016/08/21

恩，差距挺大的，统一萃取时间试试。

0

yifan1117

第3楼2016/08/21

恩，差距挺大的，统一萃取时间试试。

0

我是风儿

第4楼2016/09/04

应助达人

制备的方法不同会造成这么大的差异？

0

我是风儿

第5楼2016/09/04

应助达人

楼主，那到底是哪个方法测得的甲醛更准确呢？楼主也没有定论啊

0

zyl3367898

第6楼2016/09/04

应助达人

应该做个质控方法来验证哪个方法更准确，这两个结果相差太大。

0

夏天的雪

第7楼2016/09/06

应助达人

楼主最后貌似最后也没有找到原因啊

0

夏天的雪

第8楼2016/09/06

应助达人

食品中测甲醛最后好像是用正己烷进行萃取，然后进样的，与楼主的方法有点不同，不过可以参考一下，之前做过

0

夏天的雪

第9楼2016/09/06

应助达人

楼主做的是什么样品？

0

Flynnchen

第10楼2016/09/08

正在验证中，有结果会回复的。
夏天的雪(bingwang228)发表:楼主最后貌似最后也没有找到原因啊

0

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