如何做好ELISA（二）——操作篇

应助达人

二、酶标分析过程中的注意事项
　　样本的检测是基于抗原抗体的反应，根据标准曲线，判定样本最终的药物含量。它要求加样的准确性和洗板的一致性。在整个加样的过程中注意实验室温度的恒定，保证反应在试剂盒所示的温度下进行。
1、常见加样方式：
　　①吸一打二（即加样枪在吸液体时只打到第一档，放液时放到第二档。）
　　②吸二打一（即加样枪在吸液体时打到第二档，放液时只放到第一档。）
　　在实际操作过程中，提倡用“吸二打一”用这种方式，有如下几个好处：a、加样过程中在板孔内不出现或者很少出现气泡；b、提高加样速度，缩短前后样本反应的时间差。
　　在加样的过程中还应细心注意避免出现下列现象：①加样的过程中漏加或者重加；②加样的过程中忘记更换吸头；③样本的重加或者漏加；④忘记记录样本的加样顺序。

2、常见的洗板方式：
　　①洗板机洗板；
　　②多道孔加样器洗板；
　　③多孔吸头洗板；
　　在洗板的过程中，确保每孔所加洗涤液量的均一，按说明书操作，不可过多，避免溢出板孔，污染其它样本；过少，则达不到洗涤的效果，容易出现曲线不成线性，花板等情况。

3、甩板
　　快速甩尽板孔内的液体，防止板孔里的液体对流或反溅回板孔中产生交叉污染。

4、拍板
　　 轻轻的在吸水纸上扣干板孔内的液体，而且吸水纸只能使用一次。

5、显色
　　试剂盒中所规定的显色时间并非是绝对的，环境中的温度、湿度、酶标板反应时所接触到的物品的导热度等因素会影响吸光度值，实验操作人员在加完显色液后，可根据颜色的深浅适当的延长或者缩短显色时间。防止出现吸光值接近或高于酶标仪的最高检测限度（OD值在2.5-3.0之间），这样会间接影响到检测结果，如出现曲线前半部份梯度不明显或颠倒数值等现象，也就造成了一些假阳性或部分检测结果偏低的现象。

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三、检测结果判断
　　由于ELISA方法目前在兽药、贝类毒素、真菌毒素残留检测中主要是用作筛选方法，其判定标准可以根据下列确定：
（1）有现成方法的，采用方法的检测限作为判定标准，如农牧发［2001］38号文规定猪尿中ELISA判定标准为1 ng/mL；
（2）目前没有现成标准，但可采用其他确认方法的检测限作为ELISA检测的判断标准，如用ELISA检测饲料中的盐酸克仑特罗，可按 NY438-2001规定的 HPLC 法的最低检测限0.05 mg/kg作为饲料 ELISA 法的判定标准；采用确认方法的检测限作为ELISA方法的判定限的依据是筛选方法的阳性结果要采用其他确认方法进行确证，采用低于确认方法检测限的数值作判定值可能会引起假阳性偏高；
（3）在空白样品中添加要测定的药物，看样品基质效应的干扰情况，如用德国γ-biopharm试剂盒检测饲料中的己烯雌酚，其推荐判断标准为20 ng/g；
（4）阳性样品需用其他方法进行确证。ELISA法是快速筛选方法，由于受多种因素的影响有可能引起假阳性反应，因而对于用该法检测到的阳性样品一定要用其他方法进行确证，以排除假阳性结果。