火锅底料中4种苏丹红染料的测定与分析
摘要：建立了在线光化学衍生-高效液相色谱法同时测定火锅底料中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B的方法。样品经丙酮和乙腈的混合溶液（V:V/2:8）提取、C18固相萃取柱净化、高效液相色谱分离后，4种苏丹红染料在紫外光的照射下发生衍生反应，衍生产物进入荧光检测器测定，外标法定量。结果表明，4种苏丹红在0.10~1.0μg/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999；低、中、高3个不同加标浓度下， 4种苏丹红的回收率均大于85%，相对标准偏差为1.58%~4.36%；方法的检出限（LOD）为0.30~0.45μg /kg，定量限（LOQ）为1.00~1.50μg /kg。该方法具有重现性好、灵敏度高、结果准确的特点，适用于火锅底料中苏丹红残留的分析检测。目前将光化学衍生应用于苏丹红残留测定的文章鲜见报道。
关键词：固相萃取；光化学衍生；高效液相色谱；荧光检测法；苏丹红
1 前言
"苏丹红"是一种化学染色剂，并非食品添加剂。它的化学成份中含有一种叫萘的化合物，该物质具有偶氮结构，由于这种化学结构的性质决定了它具有致癌性，对人体的肝肾器官具有明显的毒性作用。苏丹红属于化工染色剂，主要是用于石油、机油和其他的一些工业溶剂中，目的是使其增色，也用于鞋、地板等的增光。由于用苏丹红染色后的食品颜色鲜艳且不易褪色，一些不法食品企业把苏丹红作为色素添加到食品中。
食品中苏丹红染料分析方法有分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱质谱法和气相色谱质谱法等。国家标准GB/T 19681-2005采用高效液相色谱-紫外法测定食品中的苏丹红，该方法灵敏度较低，在测定时需要切换扫描波长，不利于操作。荧光检测法具有选择性好、灵敏度高，检出限低等优点，在分析科学及其它相关领域的应用越来越多，而苏丹红的荧光响应较低，以荧光检测法测定时需要对其进行衍生，转变为具有较强荧光响应的化学结构。
光化学反应是待测物质在可见光或紫外光的照射下而产生的化学反应，待测物质的分子吸收光子后结构发生转变或者与试剂产生反应，导致化学性质发生变化，与化学衍生反应相比，具有不需要使用额外的衍生试剂，污染较小，选择性好等优点，已被广泛的应用于黄曲霉毒素的测定中，目前将光化学衍生应用于苏丹红残留测定的文章鲜见报道。本文针对火锅底料样品，采用C18固相萃取柱对样品进行浓缩、净化，建立了光化学衍生-高效液相色谱法同时测定火锅底料中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B的方法，该方法具有重现性好、灵敏度高、结果准确的特点。
2 材料与方法
2.1 仪器及设备
Waters e2695高效液相色谱仪（主要包括2475荧光检测器，柱温箱，自动进样器等）；光化学衍生器（由紫外灯、聚四氟乙烯反应管组成）；超生波清洗；离心机；旋转蒸发器；氮气吹干仪；C18 (500mg/6mL)固相萃取柱。
2.2 试剂
乙腈、甲醇和丙酮，色谱纯；无水硫酸钠，分析纯；实验用水为Millpore超纯水；
标准物质：苏丹红Ⅰ(纯度≥99.0%)，苏丹红Ⅱ(纯度≥99.0%)，苏丹红Ⅲ(纯度≥96.0%)，苏丹红B(纯度≥90.0%)。
2.3 分析测定条件
色谱柱： C18 (250mm×4.6mm ,5μm)；流动相A为乙腈，B为甲醇，梯度洗脱：0~11min，100% A；11~12min，100% A~0%A，0%B~100%B；12~25min，100% B；流速：0.8mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；荧光检测器：激发波长310nm，发射波长348nm。
2.4 样品前处理
2.4.1 样品的提取
称取2.0g试样于50.0mL离心管中，加入5.0g无水Na2SO4， 20.0mL丙酮-乙腈（V:V/2:8）溶液，超声提取20min，以5000r/min离心5min，上清液转移至250mL鸡心瓶中，残留物用20.0mL丙酮-乙腈溶液重复提取一次，合并上清液，并在40℃水浴中减压旋转蒸发浓缩至约1mL，待净化。
2.4.2 固相萃取柱富集净化
C18固相萃取柱依次用5mL乙腈、5mL水进行活化和平衡，然后将上述待净化液上样过柱，用1mL丙酮-乙腈溶液润洗鸡心瓶，并将润洗液转移至固相萃取柱中，用5mL水淋洗，再用5mL丙酮-乙腈溶液进行洗脱，收集全部洗脱液，氮气吹干，用丙酮-乙腈溶液重新定容至1mL，经0.45μm滤膜过滤后进样分析。
2.5 标准溶液的配制
分别准确称取一定质量的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B，加入少量丙酮超声溶解后转入100mL容量瓶中，用乙腈稀释成浓度为0.10mg/mL的标准储备液，放置于4℃冰箱中避光保存。临用前，分别准确吸取一定体积的0.10mg/mL的标准储备液，用乙腈逐级稀释到相应浓度的混合标准溶液。
3.结果与讨论
3.1 扫描波长的选择
采用Waters 2475荧光检测器自带的3D扫描功能分别在波长200-340nm、330-600nm范围内扫描4种苏丹红光化学衍生产物的激发波长和发射波长，扫描结果见图1。从图中看出，苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B经光化学衍生后其衍生产物的最佳激发波长分别为312nm，312nm，305nm，305nm；最佳发射波长均为348nm，因此本文选择激发波长310nm发射波长348nm作为扫描波长对4种苏丹红进行同时测定。
3.2检测方法的选择
分别采用荧光检测器和柱后光化学衍生-荧光检测器对相同浓度的4种苏丹红混合标准溶液进行测定，测定结果如图2。从图中可以看出，采用荧光检测器测定时4种苏丹红仅表现出微弱的荧光响应，不利于痕量组分含量的测定；经光化学衍生后4种苏丹红的荧光响应大为增加，这是由于苏丹红是一类萘酚偶氮结构型染料，其分子结构中的偶氮基团具有光化学活性，在光照作用下能够发生顺式和反式结构的互变，甚至能够与溶剂发生光化学反应，从而导致偶氮化合物的性质发生显著的变化，生成具有较强荧光响应的物质。
3.3 流动相的选择
分别以乙腈、甲醇、乙腈-水（V:V/98：2）、甲醇-水（V:V/98：2）、乙腈-甲醇（V:V/98：2）为流动相等度洗脱，光化学衍生后测定，考察4种苏丹红的出峰及分离情况，结果如图3。以乙腈为流动相时，4种苏丹红均能产生较强的荧光响应，且4种苏丹红具有很好的分离度；以甲醇为流动相时，苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ仅有微弱的荧光响应，响应值较低，难以满足苏丹红残留的检测要求，苏丹红Ⅲ和苏丹红B具有较强的荧光响应，与乙腈为流动相相比其响应值更高；以乙腈-水（V:V/98：2）、甲醇-水（V:V/98：2）、乙腈-甲醇（V:V/98：2）为流动相时，苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ的荧光响应均较弱，与未发生光化学衍生反应测定的响应值相近。上述实验表明苏丹红的光化学衍生反应及反应产物的荧光性质与参加反应的溶剂相关，苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ在纯乙腈条件下才能发生光化学衍生反应，当流动相中含有微量的水和甲醇时都会影响其光化学反应；苏丹红Ⅲ和苏丹红B与甲醇和乙腈均能发生光化学反应，微量的水不影响这两者的光化学反应，而且在甲醇流动相中两者的光化学衍生产物的荧光响应值更高。主要原因是随着苏丹红Ⅲ和苏丹红B分子结构中共轭体系的增大，分子极性减弱，从而在极性较弱的甲醇中表现出更强的荧光强度。因此分别选择乙腈和甲醇为光化学反应的溶剂，采用梯度洗脱的方法对4种苏丹红进行分离和测定。
3.4 样品前处理条件的选择
现有的国家标准测定苏丹红时通常采用乙腈直接提取或者氧化铝层析柱净化的方法进行样品前处理，而前者容易受到样品基质的影响，提取后存在大量的干扰物质，影响目标物质的定性和定量；后者处理方法较为繁琐，氧化铝的活性对方法回收率的影响很大。图4为空白样品和加标样品采用C18固相萃取柱净化后测定的色谱图。实验表明，C18固相萃取柱对4种苏丹红具有很好的保留作用，以水为淋洗液可以一次性去除样品中大部分水溶性干扰物质，减少杂质对苏丹红检测结果的影响，同时采用C18固相萃取柱进行样品前处理，对待测组分还具有浓缩和富集的作用，有利于降低待测组分的检出限。
3.5标准曲线、线性范围及检出限
分别准确吸取适量体积的苏丹红标准储备液，用乙腈逐级稀释成一定浓度的混合标准溶液，按上述优化的实验条件进行测定，以峰面积（y，μV·s）对质量浓度(x，μg /mL)作图，所得线性回归方程、线性范围和相关系数(R2)如表1所示。向阴性火锅底料样品中添加低浓度水平的苏丹红混合标准溶液，按照上述方法进行样品前处理后上机检测，以S/N=3为检出限（LOD），S/N=10为定量限（LOQ），结果见表1。结果表明，采用外标峰面积法定量，4种苏丹红在相应的浓度范围内均具有良好的线性关系，相关系数（R2）大于0.999。与国标方法相比，可较好地减少样品浓缩、净化等样品前处理过程带来的误差，该方法线性范围宽，检出限低，可满足实际样品的检测。
3.6 回收率和精密度
向阴性火锅底料样品中分别加入低、中、高3种质量浓度的苏丹红混合标准溶液，并以上述实验方法进行样品处理和测定, 考察实验方法的回收率，并对加标样品重复测定6次，考察实验方法的精密度。结果表明，苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B的回收率均在85%以上，相对标准偏差（RSD）为1.58%~4.36%。回收率和精密度结果见表2。
4 结论
本文以C18固相萃取柱净化样品，富集苏丹红染料，并基于紫外光照射能够增强苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和B的荧光响应，建立了光化学衍生-高效液相色谱法同时测定火锅底料中4种苏丹红染料的方法。该方法能够有效去除样品中杂质干扰，具有重现性好、灵敏度高、结果准确的特点，适用于火锅底料中苏丹红残留的分析检测。
参考文献
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