实用反相色谱分析方法开发

（一）适合HPLC方法开发的化合物

（二）反相色谱出峰原理

样品分子在极性流动相和非极性固定相之间进行分配，疏水性强（极性弱）的化合物保留强，后出峰；亲水化合物（强极性）保留弱，先出峰。

引用：使用C18色谱柱的反相方法，出现未知峰时，可大致判断该未知物质极性的强弱，给技术员参考性的建议。

官能团极性大小：

饱和烃＜烯烃＜芳烃＜有机卤代物＜硫化物＜醚＜硝基化合物＜二甲胺＜酯类＜醛＜酮＜硫醇＜胺类＜亚枫＜酰胺＜醇类＜酚类＜羧酸

（三）反相色谱条件选择

(1)各个色谱参数对分离的作用

（2）反相色谱中波长的选择

第一，对目标化合物进行全波段扫描。

第二，选取的波长需大于流动相的截止波长，反相中若用了缓冲盐，则最低205nm。

第三，含量的方法中，波长尽量选取较为平滑的峰顶或峰谷。

第四，有关物质方法中，波长需对比各个杂质及主物质在同浓度水平下的UV曲线，选取各个物质E值相当的波长，并需确认校正因子。校正因子在0.9-1.1之间以1.0来计；在0.2-5之间，校正因子法能得到较为准确的结果；若校正因子大于5或小于0.2，则需用外标法来进行计算。

（3）反相色谱中稀释剂的选择

①溶剂强度顺序

水＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氢呋喃＜丙酮＜二氯甲烷

其中二氯甲烷和水不互溶，其余和水互溶。

乙腈/甲醇/四氢呋喃和水不同比例的溶剂强度如下图

②溶剂效应

a.如何判断是否是溶剂效应呢？

稀释剂的溶剂强度大于流动相的溶剂强度，可能导致峰分裂。降低进样量，峰形明显趋向成为一个或者成为了一个峰，此为主要判断依据；或者用DAD扫描，分裂的两个峰紫外吸收曲线明显一致，此为辅助判断，因为很多分离不好的化合物的结构是接近的，紫外吸收曲线可能相差不多。

b.如何避免溶剂效应呢？

选取稀释剂时，溶剂强度应小于或与流动相初始比例的强度相当。或者在允许范围内，降低进样量。

稀释剂不仅需要溶解样品，更需要与流动相互溶。

c.溶剂效应裂峰实例

③稀释剂选择考虑因素

例1：稀释剂pH

如果用正己烷溶解了样品，在反相色谱中运行时，会与水形成液珠，可能会伤害仪器及色谱中。

有时候也需要注意稀释剂的pH，若样品中某些物质对pH很敏感，需要将稀释剂pH与流动相的pH保持一致。

例2：稀释剂稳定性-稀释剂不合适

利伐沙班某一步中间体中，流动相A为0.1%磷酸水，用乙腈-水去溶解样品时，其中一杂质会慢慢降解，最终选用乙腈-0.1%磷酸水作为稀释剂，溶液有较好的稳定性。

PS:对某些有卤素基团的化合物，需注意其是否在稀释剂中能稳定存在。

例3-1：稀释剂稳定性-温度

布瓦西坦某一步中间体中，脂肪上连接了I，经过大量实验发现，即使在纯乙腈中，室温下I也极容易掉落。最终采取稀释的方法是，将乙腈在0℃左右保存，来样后，马上用0℃的乙腈稀释，并且样品盘控温5℃。这样才抑制了样品的降解。

例3-2：稀释剂稳定性-温度

阿托伐他汀钙缺陷，需要路线前沿，某一步原料的杂质结构式苯环上连接了两个Br，在低浓度下，Br容易掉落，导致LOD,LOQ一直做不过去，最后将样品控温5℃后，才将方法确认做完。

总结：溶剂效应，与样品及流动相的溶解性，样品溶液的稳定性。

（3）流速

在色谱柱耐受的压力范围内就行，对分离影响很小。

（4）柱温

一般情况下，柱温的升高或降低，可能会改善分离，也有可能会降低分离。不要将柱温升高至临近柱子的耐受温度，尤其是在缓冲液pH6.5以上时；pH2-3时，有的色谱柱如Agilent SB系列可以耐受80℃的高温。

对于特殊的结构，柱温的变化会有显著的影响

如酮式烯醇式互变的结构。在低pH，高温下，有利于趋向酮式结构，在高pH，室温或者低温下，有利于趋向烯醇式结构。所以开发方法时，酮式烯醇式的结构需要去了解以哪个结构为主要存在的，改变柱温及缓冲液pH让其绝大部分以同一形式存在。

柱温需考虑：柱子耐受，某些特殊结构需要合适的柱温。

（5）流动相的选择

①流动相中的有机相选择

首选乙腈，乙腈-水流动相体系，可用于低波段（185nm-210nm）UV检测，乙腈水的流动相粘度非常低；

第二选择是甲醇，对比乙腈的优势是价格便宜，对缓冲盐的溶解性稍好于乙腈，但是甲醇截止波长205nm大于乙腈，而且甲醇水体系粘度大，在甲醇-水=1：1时粘度达到最大，柱压较高，需注意色谱柱是否能耐受；

最后考虑THF，THF在UV中有吸收，易氧化，更换色谱柱后平衡较慢，但是对比乙腈甲醇，有独特的选择性，对于某些不好分离的化合物，可以尝试加入少量THF。

混合有机相具有独特的选择性。

②流动相中的缓冲液选择

了解目标物的酸碱性及pKa，将缓冲液pH调节至大于或小于1.5pKa；

若是酸性化合物，pH小于其pKa会增大保留；

若是碱性化合物，pH大于其pKa会增大保留；中性化合物，pH对保留影响较小。

c.案例

例1：流动相缓冲能力优化案例

氨基酸盐酸盐化合物含量方法中， 缓冲液用的是5mM磷酸二氢钾， 样品中氨基酸的峰和标准品中氨基酸的 峰未能完全重叠在一起。如图所示：

后期将缓冲液换成5mM磷酸二氢钾和 5mM磷酸氢二钾的混合液，能完全重叠，如图所示：

原因分析：5mM磷酸盐pH4.6左右，无 缓冲能力，而两者的混合液pH6.95， 缓冲能力强。

例 2:缓冲盐析出问题案例

曾近我开发过pH7以上10mM磷酸盐缓冲液的方法，在与有机相比例达到50:50时，柱压会缓慢上升，所以遇到此类转移过来的方法，需要时刻注意柱压，若是发现每一针都比前一针压力都高，则方法需要调整，不然柱子容易损坏。

最后，将方法pH降低至6.5，用三乙胺-磷酸水的体系解决了该问题。

d.缓冲液需考虑的因素：

缓冲液pH，需大于或小于化合物1.5pKa。

UV的吸收，需大于缓冲盐的截止波长。

缓冲液和有机相的溶解度，在方法中最高有机相+5%比例下，缓冲盐未析出。

缓冲液浓度，一般5-25mM之间。

缓冲液的稳定性，比如我们很少用到碳酸盐去作为缓冲试剂，因为碳酸盐缓冲液放置后，CO2会逸出，会导致pH升高。

缓冲盐缓冲范围，若影响较大，则需尽量将pH调整在缓冲范围以内。

对HPLC系统的腐蚀，比如盐酸会对整个系统造成损伤。

（4）反相色谱中色谱柱的选择

①常用色谱柱类型

②不同耐受功能色谱柱品牌推荐

a.耐水性

b.耐高pH

c.耐高温

③固定相孔径的选择

根据分子量选择合适的孔径

N正比于长度，反比与粒径的二次方。理论上说，粒径越低的色谱柱柱效越好，但是压力也会越大，所以综合考虑，HPLC上色谱柱粒径基本选用3μm-5μm之间。

⑤固定相的选择性

(四)方法开发的步骤

首先使用封端，高纯硅胶，C18色谱柱，如Agilent XDB C18，Waters Xbridge C18，YMC Triart C18色谱柱等，开全波段扫描，选取合适的波长。

了解目标物的pKa，选择合适缓冲液，将缓冲液pH调节至大于或小于1.5pKa。

第一种方法-等度调节：将有机相调至80-100%，等度洗脱，然后慢慢调低有机相比例，直至目标物之间达到分离。

第二种方法-梯度调节：初始梯度调节为50%有机相，以5%/min比例升至80%或者100%，观察目标物之间的分离，调节初始梯度及有机相百分比的速度来达到各物质分离。

若不能将目标物完全分离，可观察哪几个结构的化合物无法分离。

有机相也可以改变化合物的分离

选用合适的缓冲液和固定相，改变有机相，乙腈，甲醇，不同比例的乙腈甲醇溶液，或者往有机相中加入1-10%THF。

实例：

阿托伐他汀钙缺陷中，前沿起始物料的方法开发，用磷酸-三乙胺水溶液作为缓冲液，甲醇-乙腈（60：:40，v/v）作为有机相，成功的分离了8个化合物，并且通过了carry-over验证。

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