【刷新认知篇】HPLC方法重现保留时间相差10min

1. 背景

在研发分析实验室中，主物质保留时间在38min左右，而QC实验室中，主物质保留时间在28min~30min。，不同实验室方法重现主物质保留时间相差10min，故进行调查。

2. 色谱参数

波长：200nm

柱温：30℃

运行时间：90min

流速：0.4mL/min

进样量：10μL

色谱柱：Welch AQ-C18 300mm*3.0，3μm

缓冲液：20mM磷酸二氢钠，磷酸调节pH=2.50

稀释剂：50mM磷酸二氢钠，磷酸调节pH=2.50

梯度：

样品浓度：5mg/mL

3. 调查实验

3.1试剂调查

分别调查了不同批号和厂家试剂对该物质保留时间的影响，实验结果见下表：

结论：试剂品牌和批号对主物质保留时间无影响。

3.2流动相耐用性考察

分别考察了pH和缓冲盐浓度对主物质保留时间的影响

结论：pH和缓冲盐浓度对主物质保留时间无影响。

3.3色谱柱考察

更换同一型号（PN完全一致），序列号不同的色谱柱进行实验

结论：色谱柱对主物质保留时间无影响。

3.4鬼峰捕集小柱考察

卸掉鬼峰捕集小柱考察主物质保留时间的影响

结论：鬼峰捕集小柱对主物质保留时间无影响。

3.5仪器考察

考察不同的仪器对主物质保留时间的影响

结论：导致主物质保留时间差异的可能是仪器型号差别引起的。

典型图谱

LC06，LC07（主物质RT=38min）左右的图谱：

LC08，LC09（主物质RT28min）左右的图谱

4. 补充实验（流速校准）

排查：LC06和LC07仪器1个月以前刚换新的比例阀，其他项目保留时间都正常，并且连续打6针主物质保留时间不漂移。所以排除比例阀因素。低流速的项目这两台仪器很少做，需校准一下0.4mL/min仪器流速是否准确。

LC06，LC07流速校准表格如下：

PS：由于方法中用的是AC通道，流速准确，对结果不会有影响。

结论：以上两台仪器流速不是造成保留时间相差10分钟的主要原因。

5. 结果推测

LC06和LC07仪器为Agilent 1260 Infinity II仪器，而LC08和LC09为Agilent 1260 Infinity仪器。QC采用waters仪器分析的结果和Agilent 1260 Infinity结果一致。引起此次保留时间相差10分钟的主要原因为仪器型号差别造成。

6. 问题解决

6.1问题咨询调研

以上问题咨询了安捷伦工厂（德国工厂），就此问题厂家也给了一个测试实验结果及相关建议

测试结果：

结论：从以上实验结果可以看出Agilent 1260 Infinity、Agilent 1260 InfinityII（历史软件版本H.07.24）和Agilent 1260 InfinityII（新软件版本D.07.24）保留时间不同（保留时间越大的，保留时间差距也会越大）。Agilent 1260 Infinity、Agilent 1260 InfinityII（历史软件版本H.07.24）两者保留时间更加接近一点。

解决方案：Agilent 1260 InfinityII（新软件版本D）泵版块激活历史版本变成H，这样Agilent 1260 Infinity、Agilent 1260 InfinityII保留时间差距会减小。

6.2解决方案验证

6.2.1使用诊断软件，打开泵设置模块，点击激活“历史版本模式”

6.2.2检查是否激活成功，确保版本D变成H

6.2.3激活历史版本后同样的色谱条件用Agilent 1260 InfinityII（H.07.28）再次做上述项目图谱如下

结果：经过历史版本激活后主物质保留时间为30.2min和Agilent 1260 Infinity及QCwaters仪器几乎一致。

7. 总结篇

流动相组成百分比很低(5%以下一个通道)或非常缓梯度(2% /分钟或更少),保留时间越大的不同仪器型号差别会很大。本项目造成保留时间相差10min的主要原因是梯度缓（0.13%/分钟）。

低比例流动相和缓梯度对仪器的精度要求很高，这也是安捷伦一直在攻克的技术难题。通过不断优化电磁阀控制、柱塞杆推动频率、比例阀的开合频率等综合因素算法来实现精度更精确！

鸣谢：感谢小豹同事对整个调查的支持！感谢安捷伦工厂给的建议！

申明：本文为个人经验分享仅代表个人观点，仅供参考，欢迎交流！

End

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