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变化的保留时间（液相色谱）

遗忘曲线

2021/08/08

液相色谱（LC）

色谱峰保留时间不固定原因：

首先，我们需要找到这种变化的模式。如果保留时间从一次运行到下一次运行随机变化，那么我将首先检查一下泵和溶剂混合装置。为验证泵是否正常工作，请使用带刻度的量筒和秒表来测量流速。如果流动相组成恒定，则基线将稳定。如果成分发生变化，您将在基线中观察到相应的变化。例如，如果您使用的是带紫外检测器的反相色谱法，你可以向有机溶剂中添加0.1％丙酮，并在254 nm处监测基线。或者，您可以手动配置流动相从而绕过溶剂混合设备。如果保留时间的波动消失了，那么问题的根源就是混合设备。

假如是同一天不同针之间的保留时间很稳定，但是不同天之间的保留时间不固定？

引起这种变化的最可能原因是流动相组成。在反相色谱中，保留因子k与流动相中有机溶剂的体积分数之间存在指数关系。根据经验，如果有机溶剂的用量误差为1％，则保留时间可在5％至15％之间变化，通常约为10％。这意味着您必须非常仔细地测量溶剂的量。最好的方法是按重量而不是按体积制备流动相。另外，如何给流动相脱气也可能导致保留时间变化。最好的脱气方法是同时采用真空和超声约一分钟。另一种好的方法是氦气吹扫。在流动相与氦气达到初步平衡后，应将氦气流量调低。否则，氦气将携带溶剂蒸气，而流动相溶剂组成可能会因此蒸发而发生变化。如果您的样品成分是离子型或可离子化的，那么控制流动相的pH值就非常重要。小至0.1pH单位的变化都可能导致保留时间10％的偏移。因此，准确测量pH值并维持pH计校准良好非常重要。在反相系统中，随着pH值的增加，酸的保留时间缩短，而碱的保留时间延长。顺便说一句，我的化学老师总是说：“缓冲液之所以称为缓冲液，是因为它应该缓冲pH值。如果不这样做，就不是缓冲液。”例如，乙酸铵溶液就是乙酸铵溶液。乙酸盐缓冲液包含乙酸根离子和乙酸。如果缓冲液中它们的存在量相同，则所得的pH值就是缓冲液的pKa值，以乙酸盐为例其pKa值为4.75。缓冲液总是在溶液pH=pKa时，缓冲能力最强。

另一个因素是温度。如果所有峰的保留时间沿同一方向移动，你就可以怀疑是温度是引起这种波动的原因。经验告诉我们，温度每变化每1摄氏度，保留时间将变化约1％至2％。在正常情况下，这变化并不显著。但在许多地方，周末会关闭暖气或空调，然后你就会疑惑为什么在周末自动运行的分析显示的保留时间与在工作日时运行的分析的保留时间不同。显然，通过使用柱温箱可有效避免这种情况发生。在检测离子型或可电离样品化合物的反相色谱法中，保留时间还受到缓冲液离子强度的影响，但影响很小，通常可以忽略不计。通常20％摩尔浓度的缓冲液变化对保留时间的影响在在1％以下。因为总是对缓冲盐进行称重后配置缓冲液，因此不可能发生如此大的错误。

在离子对色谱中，离子对试剂的浓度会影响离子样品组分的保留。与离子对试剂带相反电荷的分析物的保留时间增加，带相同电荷的分析物的保留时间减少。中性化合物几乎不受影响。当离子对试剂浓度低时，即低于5 mM/L，与试剂相互作用的样品成分的保留时间会随离子对试剂浓度的变化成比例地变化。当离子对试剂浓度高时，即大约10 mM/L，基团表面被离子对试剂吸附饱和，此时离子对试剂浓度的变化不会导致分析物的保留时间发生明显变化。在正相色谱中，保留时间对流动相中极性成分的浓度非常敏感。无论是否想要，这些成分中总是存在的一种是水。因此，水分含量的不同就可能导致保留时间的不同。解决该问题的一种诀窍是使用用水半饱和过的非极性溶剂，如己烷或二氯甲烷。为此，您需要取一定量的此溶剂并通过向其中添加一些水再搅拌一会儿使其饱和，，然后将这种水饱和的溶剂混匀后与等体积的“干燥”溶剂混合。该么操作的结果是非极性溶剂的水含量具有相当好的重现性。它还有助于防止保留时间的漂移。

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